После электрофореза: Электрофорез с медикаментозными средствами, гомеопатическими препаратами

Содержание

Электрофорез | Поликлиника ЦКБ РЖД-Медицина

Электрофорез лекарственных веществ – особый электрофармакологический метод, основанный на сочетанном использовании постоянного тока и вводимых с его помощью лекарственных веществ. Из электрических токов для лекарственного электрофореза применяются гальванический (в 80-85 %), диадинамические, синусоидальные модулированные (в выпрямленном режиме), прямоугольный импульсный и флюктуирующий (форма № 3) токи.

Механизм физиологического воздействия

При электрофорезе лекарственные вещества в организм проникают через выводные протоки потовых и сальных желез, межклеточные промежутки, волосяные фолликулы и в меньшей степени – чресклеточно. Во время процедуры лекарственные вещества проникают неглубоко: сразу после элекрофореза основная часть лекарства обнаруживается в эпидермисе и дерме, создавая депо. Однако от процедуры к процедуре глубина электрогенного перемещения вводимого препарата возрастает. К тому же следует иметь в виду, что за счет диффузии часть лекарственных веществ быстро достигает кровеносных и лимфатических сосудов, разносясь ко всем органам и тканям. Весьма важно, что из кровотока лекарственные вещества вторично поступают преимущественно в органы и ткани, расположенные в зоне проведения процедуры. Это обосновывает целесообразность использования лекарственного электрофореза для лечения как поверхностно, так и глубоко расположенных патологических процессов, а также заболеваний внутренних органов.

Действие лекарственного электрофореза как электрофармакологического метода складывается из сочетанного действия физического фактора (гальванический или другие токи) и введенного лекарственного вещества. Ответная реакция организма при этом не является простой суммацией эффектов, вызванных этими двумя факторами, составляющими единый терапевтический комплекс. Она значительно сложнее и разнообразнее. Важно помнить, что действие вводимых электрофорезом лекарств развивается несколькими путями (рефлекторное, местное и гуморальное) и, варьируя технику и методику проведения процедуры, ими можно управлять.

Особенности и достоинства лекарственного электрофореза:

1. Лекарственные вещества, вводимые электрофорезом, задерживаются в поверхностных слоях кожи и образуют здесь так называемое кожное депо ионов. В нем лекарства могут сохраняться от 12-24 ч до 15-20 суток (адреналин, цинк, медь и др.). Задержка введенных веществ в кожном депо способствует их более длительному действию и медленному выведению из организма.

2. Метод лекарственного электрофореза позволяет создавать высокую локальную (в патологическом очаге) концентрацию препарата, не насыщая им весь организм. Согласно имеющимся данным, после электрофореза содержание лекарств в тканях области воздействия в несколько раз выше, чем после общепринятых способов введения той же дозы препарата.

3. В отличие от инъекционных способов введения электрофорез позволяет доставить лекарства к патологическому очагу, в котором имеются нарушения микроциркуляции и регионарного кровообращения в виде капиллярного стаза, тромбоза сосудов, инфильтрации и некроза. Такие патологические очаги плохо поддаются лечению традиционными фармакотерапевтическими методами, т.к. поступление лекарственных веществ в них затруднено. При электрофорезе же лекарственные вещества могут поступать в патологический очаг не только гематогенным, но и электрогенным путем.

4. При электрофорезе побочные и аллергические реакции наблюдаются во много раз реже, чем при пероральном или парентеральном применении этих же лекарств. Уменьшение или полное отсутствие побочных реакций при электрофорезе обусловлено рядом причин: невысокой концентрацией лекарства в крови; введением их в наиболее чистом виде; положительным влиянием физического фактора на общую реактивность и иммунобиологический статус организма и др

5. При электрофорезе в организм вводятся только те лекарственные ионы или ингредиенты лекарств, на терапевтическое действие которых рассчитывают. Противоионы и различные примеси, которые могут тормозить действие основного лекарственного иона, в организм при этом не попадают, а остаются на прокладке.

6. В соответствии с сущностью метода при электрофорезе в организм лекарства поступают в виде ионов. И это очень важно, т.к. в ионной форме лекарства значительно активнее, чем в молекулярной, в которой они вводятся при обычных способах их применения.

7. Многих пациентов, прежде всего детей, пожилых пациентов привлекает абсолютная безболезненность метода при его правильном проведении.

8. При лекарственном электрофорезе исключается введение в организм растворителя. Это немаловажное достоинство метода, ибо вводимый при других способах лекарственной терапии растворитель деформирует кожу, нарушает микроциркуляцию и метаболизм в ней, может служить причиной развития постинъекционных инфильтратов.

9. При всей важности приведенных выше особенностей метода все же основным достоинством лекарственного электрофореза, думается, является то, что лекарственное вещество здесь действует на фоне различных, имеющих терапевтическое значение изменений, вызываемых используемым электрическим током. Именно благодаря этому отчетливое специфическое и выраженное лечебное действие вводимых электрофорезом лекарств проявляется при более низких концентрациях, которые при обычных путях их введения были бы малоэффективны.

Продолжительность процедуры зависит от локализации воздействия и вида используемого тока. При общих и сегментарно-рефлекторных методиках она обычно не превышает 15-20 мин, а при местных процедурах – 30-40 мин. Использование флюктуирующих или синусоидальных модулированных токов (в выпрямленном режиме) требует некоторого уменьшения продолжительности лекарственного электрофореза, а при проведении его по методике электросна длительность воздействия, наоборот, обычно удлиняется. Курс лечения лекарственным электрофорезом в зависимости от тяжести состояния больного может быть различным по продолжительности: от 10-12 до 16-20 процедур, проводимых ежедневно или через день.

Показания:

Для лекарственного электрофореза определяются фармакотерапевтическими свойствами вводимого препарата, а также показаниями к использованию физического фактора (гальванического или других постоянных токов). В связи с широким перечнем лекарств, пригодных для электрофореза, и разнообразием используемых электрических токов показания для назначения метода весьма разнообразны.

В принципе трудно найти заболевание, при котором не мог бы быть назначен лекарственный электрофорез

. Наиболее целесообразно лекарственный электрофорез применять при тех заболеваниях, при которых показаны как лекарственные вещества, так и используемый при этом электрический ток.

Противопоказания:

  • индивидуальная непереносимость лекарственного вещества,
  • противопоказания к использованию лекарства и самого электрического тока

 

СТОИМОСТЬ УСЛУГ

 

Запись по телефонам:
+7 (499) 262-11-29, +7 (499) 262-93-61

Физиотерапевтическое отделение
Центральная поликлиника ОАО «РЖД»
Москва, ул. Новая Басманная, д. 5

 

Физиотерапия: зачем нас бьют током

Что такое физиотерапия?

Это лечение физическими факторами: электрическим током, светом, ультразвуком, излучением, а также всем тем, что нам дала природа: солнцем, воздухом, водой и грязью. К физиотерапии относится и массаж, то есть механическое воздействие.

Так лечили, когда медицина была в зачаточном состоянии, и уже тогда это помогало. Сейчас у физиотерапии много возможностей и мало противопоказаний, поэтому это одна из самых интересных отраслей в медицине.

Зачем она нужна?

Физиотерапия нужна для быстрого выздоровления и восстановления после болезней. Когда заболевание хроническое, физиотерапия помогает поддерживать форму и жить без обострений.

Физиотерапия нужна, когда лекарства и операции не приносят должного эффекта или помогают не полностью. Некоторые болезни, особенно травмы, вообще с трудом поддаются лечению. Зато постепенная реабилитация даёт результаты.

Хотите побыстрее забыть о последствиях болезни — направляйтесь в физкабинет.

Как работают процедуры?

Физиотерапия — большая отрасль, поэтому каждый вид лечения воздействует на организм по-своему.

Процедуры улучшают кровообращение и усиливает обменные процессы. Вместе с ними усиливается и регенерация, то есть самостоятельное восстановление тканей, поэтому физиотерапия помогает при язвах, болезнях кожи и так далее. Это методы гальванизации, импульсные токи, токи высокой частоты, ультразвук.

С помощью популярного электрофореза можно вообще загнать лекарство в ткани рядом с больным местом, чтобы препараты поступали именно в очаг боли и не проходили через желудок и кишечник.

Ток стимулирует нервную систему, помогает мышцам расслабляться и сокращаться (метод электростимуляции).

Эффекты тепла и света работают похожим образом: заставляют кровь двигаться быстрее и ускоряют восстановление после травм или заболеваний. Это лазерная терапия, электромагнитные колебания сверхвысокой частоты.

Процедуры увеличивают фагоцитарную активность — когда клетки организма сами уничтожают бактерии, вирусы и другую заразу. Можно сказать, у них повышается аппетит, так что это полезно после перенесенной инфекции. Для этого применяют инфракрасные лучи, ультрафиолет.

Физиотерапия расслабляет гладкую мускулатуру, из которой состоят внутренние органы и сосуды, улучшает питание тканей. Поэтому её используют при сердечно-сосудистых заболеваниях и любых проблемах с внутренними органами.

Когда назначают физиотерапию?

Решение принимает лечащий врач. Он же выбирает необходимую процедуру и её длительность.

Физиотерапию могут назначить практически во всех случаях, когда перенесённая болезнь серьёзнее банальной ОРВИ, после травм или когда заболевание перешло в хроническую форму. Восстановление и укрепление организма лишними не бывают.

Кому нельзя проводить процедуры?

Физиотерапию не назначают в острой стадии, если болезнь проявилась недавно или вышла из-под контроля. Также физиотерапию проводить нельзя, если есть:
  • онкологические заболевания;
  • заболевания крови;
  • высокая температура;
  • сильные боли;
  • кровотечения.

Существуют противопоказания к отдельным процедурам, они связаны с непереносимостью определённого вида лечения.

Бывают ли побочные эффекты?

Да, как и у любого метода. Проблемы выявляются сразу в процессе процедуры: неприятные ощущения, покраснения, отёки, боль, ожоги. Серьёзные повреждения очень редки, потому что воздействие на организм минимальное.

Можно ли как-то без процедур?

Можно, если вы и так хорошо себя чувствуете. Физиотерапия — это замена здоровому образу жизни, когда пациент не может заниматься реабилитацией (из-за сильной слабости) или просто не хочет этого делать. Тогда приходится стимулировать организм дополнительно.

А если вам больно и плохо, то выполните все назначения врача и доберитесь до кабинета физиотерапевта.

Это больно?

Как правило, во время физиотерапии неприятные ощущения минимальны. От тока или тепла появляется покалывание, чувство жжения, но они не должны быть сильными.

Большая часть процедур даже приятна. Например, подышать влажным морским воздухом — это тоже физиотерапия. Длительные прогулки по горам и бег — это физиотерапия. Регулярные физические упражнения, зарядка и разминка, ванны, электросон и массаж — это физиотерапия.

Правда, что некоторые аппараты помогают от всего на свете?

Нет, конечно же. У физиотерапии неспецифическое действие. То есть она не устраняет причину болезни, она помогает организму лучше работать и быстрее восстанавливаться. Именно поэтому одинаковые процедуры назначают при совершенно разных заболеваниях.

Ни один метод не может бороться со всеми заболеваниями. Физиотерапия только помогает чувствовать себя лучше.

Один аппарат может применяться при разных заболеваниях. Но один аппарат не может их вылечить.

Вся физиотерапия эффективна?

Нет. Все мы разные. Одна и та же процедура кому-то поможет больше, кому-то меньше. Это зависит и от формы основного заболевания, и от состояния в целом.

Существуют и явно антинаучные методы, которые не имеют никакого отношения к физиотерапии и к медицине вообще, например биорезонанс или магнитные браслеты.

Физиотерапия после операции/Реабилитация | Первый клинический медицинский центр

ПОСЛЕОПЕРАЦИОННАЯ РЕАБИЛИТАЦИЯ: ВОЗВРАЩЕНИЕ К ПОЛНОЦЕННОЙ ЖИЗНИ

            Особенности послеоперационной реабилитации                    

Еще 10-15 лет назад в нашей стране реабилитационных учреждений было очень мало, зачастую люди проходили восстановительное лечение дома, под присмотром медсестры. Нет ничего удивительного в том, что реабилитация зачастую затягивалась на долгие месяцы, а то и годы, и нередко человеку так и не удавалось вернуться к привычной жизни, а тем более в большой спорт.

В Первом клиническом медицинском центре можно пройти все необходимые диагностические анализы и исследования, сделать операцию с использованием новейших методик и на высокоточном оборудовании у хирургов с огромным опытом работы, а затем пройти полный курс послеоперационного восстановления.  Первый КМЦ располагает большими возможностями восстановительной реабилитационной медицины, и это очень удобно для пациента:  он остаётся под наблюдением лечащего и оперирующего врачей, контролирующих процесс выздоровления. А высококвалифицированные и заботливые доктора физиотерапевтического отделения помогут полностью восстановиться в максимально короткие сроки.

Современное
оборудование

Заботливые
врачи

Все услуги
в одной клинике

Персонал Первого КМЦ оказывает высококвалифицированную и надежную помощь при транспортировке пациентов, прибывших на лечение из  Москвы или  из других регионов.

И это не так дорого, как принято считать – пребывание в  Первом клиническом медицинском центре для полноценной реабилитации после операции сопоставимо по цене с проживанием в хорошем пансионате или отеле. Только ехать никуда не нужно: все процедуры можно пройти с комфортом и под контролем врачей в одной клинике.

Первый клинический  медицинский  центр предлагает пациентам курсы реабилитации и восстановления по доступным ценам и гибкие условия оплаты, в том числе возможность кредитования. Первый КМЦ – клиника европейского уровня, предлагающая разнообразные методы восстановления, комплексные программы реабилитации и индивидуальный подход к каждому пациенту.

Здесь проводят восстановительное лечение после травм, операций, инфарктов и инсультов.

В Первом клиническом медицинском центре проводят множество видов разнообразных операций, и программы восстановительной терапии  после каждого из них индивидуальны.

Однако все виды восстановительной реабилитационной терапии  преследуют одинаковые цели – снять болевой синдром, ускорить регенерацию тканей и заживление ран, сохранить нормальное кровообращение в прооперированных областях и мышечный тонус, избежать послеоперационных осложнений и сохранить все функции организма в том случае, если человек вынужден долгое время соблюдать постельный режим. Большое значение имеет и психологическая поддержка.

Обычно реабилитационный период после операции занимает от 1,5 до 6 месяцев,  но может  занять и больший срок – все зависит от характера операции, возраста и состояния пациента.
Методы восстановления организма после операции

Физиотерапевтические  методы лечения занимают заметное место в послеоперационной реабилитации.
Широко применяются:

— электрофорез;
— магнитотерапия;
— лечение ультразвуком, лазером и другие методы.

 Физиотерапевтические процедуры можно проводить буквально на следующий день после операции.

Физиотерапия полезна не только сама по себе – она значительно увеличивает эффективность других методов, снижает риск возникновения осложнений и сокращает период восстановления. Она позволяет снизить дозу обезболивающих и противовоспалительных препаратов, улучшить кровоснабжение и мышечный тонус, снять воспаление и отек. Существует множество физиотерапевтических методов, и некоторые из них входят во все программы послеоперационной реабилитации.

Программа использования физиотерапии в послеоперационный период операций направлена на решение следующих задач:

— скорейшее снятие отека оперированных тканей;

— предупреждение фиброзирование и гиалиноза формирующихся рубцов;

— активизация фагоцитоза в раневой зоне;

— скорейшее восстановление структуры кожи и тканей.

Синдромы
Задачи
Методы
1. Отек тканей
Ускорить рассасывание отека
Низкочастотная магнитотерапия,
Криотерапия
2. Опасность инфекции и медленного рубцевания
Предупредить фиброзирование и гиалиноз формирующихся рубцов
КУФ-облучение, Д’Арсонвализация
3. Нарушение венозного оттока и лимфотока
Подавить инфекцию и активизировать фагоцитоз рубцовой ткани
Лазеротерапия, гальванизация, магнитотерапия
4. Подкожные кровоизлияния и нарушение структуры глубокой дермы
Восстановить крово- и лимфоток в формирующийся рубцовой ткани
Ультразвуковая терапия
5. Формирование келоидных рубцов
 
Предупредить образование неструктурированных грануляций
Фонофорез и электрофорез с ферментными препаратами
6.Восстановление функции дыхания после операции
Предупредить застойные явления в бронхах и легких
Ингаляции лекарственных препаратов

Массаж

Лечебный массаж практически не имеет противопоказаний и активно используется в процессе реабилитации после травм и операций. Он стимулирует кровоток, улучшает работу центральной нервной системы, ускоряет процессы восстановления, снимает отеки. Дополнить его эффект могут лекарственные мази и гели.

Психотерапия

Резкие и драматичные перемены в образе жизни, ограничение возможностей, боль и выпадение из привычного круга общения пагубно сказываются на психике, а подавленное состояние, в свою очередь, замедляет восстановление. Получается порочный круг, и, чтобы вырваться из него, пациентам нужна не только поддержка и внимание близких, но и работа с психотерапевтом.

Первый КМЦ практикует мультидисциплинарный подход, составляя индивидуальную программу для каждого пациента.

Реабилитационные программы включают множество разных методик, традиционных и авторских: физическую терапию, кинезитерапию, рефлексотерапию, механотерапию, занятия по бытовой адаптации, лечебную физкультуру, массаж, индивидуальные занятия с психологом и логопедом, теплолечение.

Еще до опе­ра­ции  соберите как мож­но боль­ше ин­фор­ма­ции о том, как долж­на про­хо­дить ре­а­би­ли­та­ция, узнай­те об ос­нов­ных ме­то­дах, про­дол­жи­тель­нос­ти и воз­мож­ных рис­ках. Так вы за­ра­нее бу­де­те знать, что вас ожи­да­ет, и смо­же­те рас­пла­ни­ро­вать свое вре­мя и бюд­жет.

Если отнестись к курсу реабилитации серьезно, то можно быстро вернуться к полноценной жизни. Очень часто выздоровление затягивается именно потому, что люди, перенеся операцию, пренебрегают восстановительной терапией, думают, что здоровье «само восстановится». Действительно, ресурсы нашего организма огромны, но – не беспредельны. И чаще всего без помощи опытных реабилитологов не обойтись. Поэтому лучше не придумывать себе дополнительных испытаний и довериться опытным специалистам. И тогда, возможно, уже после нескольких недель правильных реабилитационных мер вы забудете о том, что когда-то были больны. 

Записаться на приём

Эндоназальный электрофорез на ранних сроках после септопластики и подслизистой лазерной вапоризации нижних носовых раковин Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

Методы лечения

Эндоназальный электрофорез на ранних сроках после септопластики и подслизистой лазерной вапоризации нижних носовых раковин

Н.Л. Кунельская, Г.Ю. Царапкин, М.Ю. Поляева

Московский научно-практический центр оториноларингологии Департамента здравоохранения Москвы

Методом выбора лечения искривленной носовой перегородки является септопластика с внутриносовым шинированием сплинтами. Физиотерапевтическое воздействие существенно снижает послеоперационное воспаление в строме нижних носовых раковин. Разработка малоинвазивного метода физического воздействия на тканевое воспаление в раннем послеоперационном периоде является актуальной задачей, решение которой позволило улучшить функциональные результаты лечения.

Ключевые слова: септопластика, физиотерапия, эндоназальный электрофорез.

Вопросы адекватной коррекции внутри-носовых структур по-прежнему актуальны. В настоящее время разработаны и внедрены в практику методы септального шинирования и секционной гидротампонады полости носа, значительно снижающие травматизм хирургического лечения деформации перегородки носа и хронического ринита.

Любое хирургическое вмешательство в полости носа вызывает яркий воспалительный ответ, затрагивающий как слизистую оболочку, так и подлежащие ткани — кавернозную, хрящевую и костную. Повышенная экссудация, снижение активности мерцательного эпителия слизистой оболочки и выраженный послеоперационный отек стромы нижних носовых раковин при воспалении ведут к расстройству дыхательной функции носа. Носовая обструкция является причиной вегетативных расстройств, которые, в свою очередь, определяют состояние пациента в раннем послеоперационном периоде.

На данный момент не существует общепринятой методики ведения пациентов,

Контактная информация: Поляева Мария Юрьевна, [email protected]

перенесших септопластику с хирургической коррекцией измененных носовых раковин, в раннем послеоперационном периоде. Послеоперационное лечение обычно направлено на купирование воспаления и восстановление функционального статуса носа. Традиционно применяется анемиза-ция слизистой оболочки с последующим туалетом полости носа (эвакуация раневого отделяемого, удаление фибринового налета и геморрагических корочек). Официальные лекарственные препараты, призванные купировать послеоперационное воспаление, в полости носа действуют поверхностно, не проникая в подлежащие ткани. Это объясняется как фармакологическими свойствами препаратов, так и нарушением всасывающей функции слизистой оболочки полости носа.

Неоценимую помощь в решении вопроса лечения внутритканевого воспаления может оказать эндоназальный электрофорез. Однако узкие носовые ходы и отсутствие специализированных насадок значительно сокращают возможности применения эффективного метода физиотерапии. Между тем электрофорез как способ доставки ле-

Эндоназальный электрофорез

карственных веществ в строму органа имеет ряд преимуществ по сравнению с другими физиотерапевтическими методами. Это, в свою очередь, объясняет богатую историю использования эндоназального электрофореза в терапии, неврологии, оториноларингологии и офтальмологической практике.

С внедрением в практику эндоназальных глюкокортикостероидных препаратов данный способ лечения хронических ринитов постепенно отошел на вторые позиции. Необходимо также отметить, что на ранних сроках после внутриносовых хирургических вмешательств эндоназальный электрофорез применяется крайне редко и ограничивается в основном проекционным физическим воздействием. Данное обстоятельство объясняется высоким риском развития послеоперационного носового кровотечения. Современное хирургическое оборудование и новые методики ринологических операций дают основание для пересмотра тактики ведения раннего послеоперационного периода с применением эндоназаль-ного физиотерапевтического воздействия на ткани, находящиеся в состоянии послеоперационного воспаления. На наш взгляд, работа в данном направлении актуальна, так как ранняя функциональная реабилитация пациента является приоритетной целью современной медицины.

Предложенная нами методика проведения эндоназального электрофореза сравнивалась с традиционной. Физиотерапевтическое лечение проводилось в раннем послеоперационном периоде у пациентов, перенесших септопластику и лазерную вапоризацию нижних носовых раковин.

Целями исследования явились повышение эффективности хирургического лечения пациентов, перенесших хирургическую коррекцию эндоназальных структур, сокращение сроков реабилитации и улучшение качества жизни пациентов.

Материал и методы

В период с 2009 по 2012 г. под наблюдением находилось 102 пациента (54 мужчи-

ны и 48 женщин) в возрасте от 18 до 52 лет с искривлением перегородки носа и хроническим вазомоторным ринитом (нейрове-гетативная форма). Всем пациентам проведена септопластика и подслизистая лазерная вапоризация нижних носовых раковин.

На последнем этапе хирургического лечения перегородку носа шинировали оригинальными сплинтами по методике А.И. Крюкова и Г.Ю. Царапкина. Учитывая, что применялся «бескровный» метод подслизистой лазерной вапоризации и осуществлялась полная иммобилизация перегородки носа септальными стентами, больных после операции вели без применения тампонады (оригинальная методика А. И. Крюкова). В раннем послеоперационном периоде всем пациентам ежедневно выполняли внутриносовую анемизацию и туалет полости носа.

Методом рандомизации все пациенты были разделены на три равные по численности группы, сопоставимые по полу, возрасту и сопутствующей патологии. Пациентам 1-й группы (п = 34) после проведенной операции перегородку носа фиксировали септальными шинами, эндоназальный электрофорез проводили по стандартной методике при помощи эндоназальных электродов. Пациентам 2-й группы (п = 34) перегородку носа после операции фиксировали оригинальными сплинт-электродами и ежедневно проводили физиотерапевтическое лечение. Лицам 3-й (контрольной) группы (п = 34) перегородку носа фиксировали силиконовыми шинами, послеоперационное ведение было стандартным, но без назначения методов физиотерапии. Физиотерапевтическое лечение с помощью аппарата «Поток-1» начинали с 1-го дня после операции. Сила постоянного тока составляла 1,0—2,0 мА, время экспозиции — 7—12 мин, количество процедур — 5—6 на курс лечения. В качестве лекарственного вещества использовали 2% раствор хлористого кальция.

Общепринятая методика проведения эн-доназального электрофореза заключалась в

Методы лечения

Силиконовая септальная шина с интегрированным электродом для проведения эндона-зального электрофореза.

том, что на стандартный металлический электрод, имеющий форму стержня (диаметр 1,75 мм, длина 40 мм), накручивали стерильную вату. Далее электроды, смоченные лекарственным препаратом, вводили в каждый носовой ход и подключали к аппарату «Поток-1». После окончания процедуры электроды удаляли.

На наш взгляд, классическая методика проведения эндоназального электрофореза имеет два существенных недостатка: инва-зивность и сложность в осуществлении контроля места установки электрода. В связи с этим было принято решение об усовершенствовании традиционной методики. С момента окончания операции и до конца лечения электрод должен находиться в полости носа, что позволит снизить травмирующую составляющую при проведении эн-доназального электрофореза. Кроме того, электрод должен быть постоянно ориентирован вдоль нижней носовой раковины, так как данная структура полости носа является «точкой приложения» лечения.

Решением поставленной задачи стало совмещение электрода с септальным стен-том. За прототип был взят оригинальный внутриносовой сплинт, разработанный А.И. Крюковым на основе векторного изучения анатомии полости носа по данным компьютерной томографии. По нашему мнению, септальный стент с интегриро-

ванным электродом помимо фиксирующей и экранирующей функций обладает еще одним преимуществом: он будет постоянно ориентирован в полости носа.

Учитывая то, что электроды находятся в полости носа длительное время и не должны подвергаться окислению, они были изготовлены из медицинской стали промышленным способом. Каждый электрод представлял собой металлическую пластину, имеющую следующие параметры: длина 56 мм (длина оригинального сплинта 50 мм), ширина 4 мм, толщина 0,6 мм.

В силиконовый сплинт, имеющий анатомическую форму, запаивали электрод. Особенностью данной конструкции явилось то, что латеральная поверхность электрода, обращенная в общий носовой ход, не была покрыта силиконовой резиной. Электрод располагали под наклоном 10° к основанию септального стента, а его хоанальный конец находился на 7 мм выше нижней кромки сплинта (рисунок).

Таким образом, при шинировании перегородки носа оригинальными сплинт-элек-тродами рабочий элемент для проведения электрофореза постоянно находился в полости носа на протяжении всего курса лечения. Перед началом физиотерапевтической процедуры в полость носа вводилась лишь ватная турунда, смоченная лекарственным препаратом.

Полный срок наблюдения составил 30 дней. Для оценки эффективности проводимого лечения мы использовали определенный набор критериев. Особенностью данного исследования явилось то, что некоторые показатели оценивались отдельно для левого и правого носовых ходов. Для оценки воспалительных проявлений в нижних носовых раковинах мы использовали визуальную аналоговую шкалу (ВАШ) для левого и правого носовых ходов в динамике: первые 5 сут — ежедневно, далее на 7-й, 10-й, 15-й и 30-й дни лечения. Динамические изменения воздухопроводящей функции носа оценивали по данным передней

активной риноманометрии (ПАРМ) до операции, а также на 7-й и 30-й дни лечения.

Состояние мерцательного эпителия нижних носовых раковин обоих носовых ходов оценивалось на основании результатов цитологических исследований. Забор цитологического материала проводили на 10-е сутки после хирургического лечения. Сравнивая два способа проведения эндо-назального электрофореза, мы изучали субъективную оценку пациентов переносимости физиотерапевтических манипуляций по данным показателей ВАШ.

Результаты и обсуждение

Анализ результатов лечения позволил установить, что пациенты 1-й группы хуже переносили процесс установки стандартных электродов в полость носа. На протяжении всего курса лечения все пациенты этой группы при введении активного электрода в полость носа отмечали выраженный дискомфорт, граничащий с болевым ощущением. Оценка по ВАШ после первой процедуры была наибольшей и в среднем по группе составила 4,31 ± 0,21 балла. Далее наблюдалось некоторое снижение указанного показателя, однако и к 5-й процедуре выраженность субъективных ощущений находилась в пределах 3,62 ± 0,18 балла по ВАШ.

Пациенты 2-й группы также отметили максимальный дискомфорт во время первой процедуры эндоназального электрофореза. Оценка по ВАШ составила 2,13 ± ±0,11 балла, что на 49,4% ниже, чем у пациентов 1-й группы (р < 0,05). К 4-й и 5-й процедурам электрофореза пациенты 2-й группы отмечали минимальные проявления дискомфорта, при этом оценка по ВАШ снизилась до 0,24 ± 0,02 балла, что на 93,3% ниже показателей 1-й группы (р < 0,05).

Воспалительные проявления со стороны нижних носовых раковин оценивали по показателям гиперемии и отека и интерпретировали по разработанной нами 5-балльной шкале. В 1-е сутки после операции проявления отека и гиперемии во всех трех клинических группах были сопо-

ставимы между собой по степени выраженности, не имея статистически достоверных различий. Далее у пациентов 1-й группы отек нижних носовых раковин програди-ентно уменьшался, однако гиперемия слизистой оболочки оставалась на довольно высоком уровне вплоть до 7-го дня лечения. Во 2-й группе происходило уменьшение как отека, так и гиперемии. У пациентов 3-й группы гиперемия слизистой оболочки уменьшалась постепенно при сохранении признаков отека раковин.

Рассматривая функциональные аспекты качества носового дыхания, следует указать, что основное значение в этом случае придается отеку в тканях полости носа. После окончания курса лечения выявлено достоверное (р < 0,05) снижение величины отека во 2-й группе (до 0,16 ± 0,01 балла) по сравнению с 1-й (до 1,41 ± 0,07 балла) и 3-й (до 3,99 ± 0,21 балла) группами.

При изучении отдаленных результатов лечения (30-й день после операции) выявлено, что у всех пациентов проявления послеоперационного воспаления в нижних носовых раковинах полностью отсутствовали.

Для оценки воздухопроводящей функции носа осуществлялось изучение суммарного объемного потока (СОП) и суммарного сопротивления (СС) при постоянном давлении риноманометра 150 Па. За нормальные значения принимали величину показателя СС до 0,29 Па, а СОП — 700 см3/с и более. Результаты динамического исследования воздухопроводящей функции носа представлены в таблице.

Как следует из таблицы, к 7-му дню лечения у пациентов 2-й группы значения функциональных показателей носового дыхания соответствовали нижней границе нормы. Изменения величины показателей СС находились в прямой взаимосвязи с данными динамического изменения величины послеоперационного отека нижних носовых раковин.

Согласно данным сравнительного цитологического исследования мазков-отпечатков со слизистой оболочки нижних носо-

Методы лечения

Динамика показателей ПАРМ на фоне проводимого лечения (р < 0,05)

Группа Срок проведения

до операции 7-е сутки лечения 30-е сутки лечения

СОП, см3/с СС, Па СОП, см3/с СС, Па СОП, см3/с СС, Па

1-я 216,7 ± 11,8 0,59 ± 0,03 399,1 ± 19,2 0,47 ± 0,02 672,1 ± 33,6 0,34 ± 0,03

2-я 220,3 ± 15,4 0,61 ± 0,03 476,2 ± 23,8 0,34 ± 0,02 717,7 ± 35,8 0,34 ± 0,02

3-я 218,6 ± 13,1 0,57 ± 0,04 357,8 ± 17,7 0,54 ± 0,03 591,3 ± 29,5 0,36 ± 0,01

вых раковин, у пациентов 2-й группы отмечалась менее выраженная лейкоцитарная реакция, практически отсутствовали признаки незавершенного фагоцитоза со слабо выраженными дегенеративными изменениями как в лейкоцитах, так и в эпителиальных клетках. По сравнению с пациентами 1-й и 3-й групп у пациентов 2-й группы реже отмечались реактивные изменения в клетках и атипия реактивного характера, чаще встречались клетки со слизеобразова-нием, мерцательные клетки, реже отмечались явления плоскоклеточной метаплазии.

При комплексной оценке результатов исследований (показатели ПАРМ и выраженность воспалительного отека), прямо или косвенно отражающих функциональное состояние носа как органа, обеспечивающего воздухопроведение, выявлено, что у пациентов 2-й группы восстановление носового дыхания наступало через 6,13 ± 0,31 сут. Сравнивая аналогичные показатели, полученные при динамическом наблюдении пациентов 1-й и 3-й групп, зафиксировано удлинение сроков функциональной реабилитации до 10,42 ± 0,62 и 16,21 ± 0,81 сут соответственно.

Оценивая характер и частоту возникших осложнений, отмечено, что у пациентов 2-й и 3-й групп ранний период лечения протекал без осложнений. В 1-й группе у

4 пациентов во время эндоназальной установки электродов развилось кровотечение, 1 пациент из-за возникшего дискомфорта в связи с установкой электродов отказался от проведения дальнейшего физиотерапевтического лечения.

Таким образом, при использовании эндо-назального электрофореза в раннем послеоперационном периоде у пациентов, перенесших септопластику и подслизистую лазерную вапоризацию нижних носовых раковин, функциональное восстановление носа происходит в среднем на 4,09 ± 0,35 сут раньше, чем при проведении эндоназально-го электрофореза по стандартной методике.

Разработанный нами оригинальный сеп-тальный стент с интегрированным электродом делает процедуру лечебного воздействия менее травматичной. Применение эн-доназального электрофореза с оригинальными сплинт-электродами на ранних сроках после эндоназальных хирургических вмешательств ведет к сокращению сроков реабилитации пациентов. Данная методика может быть рекомендована к широкому применению в практическом здравоохранении.

С рекомендуемой литературой вы можете ознакомиться на нашем сайте www.atmosphere-ph.ru

Endonasal Electrophoresis Early after Septoplasty

and Submucosal Laser Vaporization of the Inferior Turbinates

N.L. Kunelskaya, G.U. Tsarapkin, and M.U. Polyaeva

Septoplasty with nasal septal splints is the method of choice in the treatment of nasal septum deviation. Physical therapy significantly reduces postoperative inflammation of the inferior turbinates. Minimally invasive physical therapy improved functional results in the early postoperative period. Key words: septoplasty, physical therapy, endonasal electrophoresis.

Фиксация после электрофореза гелей — Справочник химика 21

    Во всех описанных способах белки перед окрашиванием или в его процессе фиксируют осаждением кислотой и спиртом. Однако некоторые основные белки (например, рибонуклеаза и протамин), а также низкомолекулярные пептиды и гормоны при такой обработке не осаждаются, а, наоборот, растворяются и вымываются из геля. Недавно был предложен принципиально иной подход к фиксации белков и пептидов в геле после электрофореза. Гель в течение 1 ч вымачивают в 5%-ном растворе формальдегида в 25%-НОМ этаноле с добавлением СВВ R-250 до 0,11%. В этих условиях формальдегид ковалентно сшивает пептиды с матрицей геля за счет образования метиленовых мостиков между аминогруппами аминокислот и первичными аминами ПААГ. На приведенных в работе фотографиях можно видеть разительный эффект обнаружения щелочных и низкомолекулярных белков гели, кажущиеся пустыми при обычном окрашивании, на самом деле содержат множество белковых полос. Гели с ДДС-Na красят более продолжительное время (до 3 ч) в 3,5%-ном рас- [c.93]
    Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и вымачивают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты выпадают в осадок в том самом месте, где закончилась их миграция в ходе электрофореза. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связываюш егося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют. На фотографии окрашенного цилиндрического ПААГ (рис. 2) хорошо видны четкие, узкие полосы разделившихся компонентов исходной смеси белков. [c.5]

    Обнаружение и локализацию белковых зон после их разделения электрофорезом в ПААГ в большинстве случаев осуществляют путем их прокраски в геле. Зоны проявляются как окрашенные полоски или пятна различной интенсивности, в зависимости от содержания в них белка. Для окраски гель вымачивают в растворе красителя, который диффундирует внутрь него и прочно связывается с белками. Процесс диффузии, как правило, занимает несколько часов. Во избежание размывания полос за это время белки иногда предварительно фиксируют осаждением. Для этого гель сначала вымачивают в 10%- или 50%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ). Чаще фиксацию совмещают с окрашиванием, используя раствор красителя в. смеси уксусной кислоты и метанола или в ТХУ. [c.88]

    Для выявления области геля, содержащей гибридный белок, после электрофореза вымочите гель в охлажденном 0,1 М КС1. Холодный раствор, содержащий ионы К+, преципитируют ДСН в дорожках геля, в результате чего появляются соответствующие фракционированным белкам белые полосы. Такую полосу, соответствующую гибридному белку, можно вырезать из геля острой бритвой. Это устраняет необходимость фиксации и окраски кумасси полосы геля с исследуемым белком или параллельных дорожек геля. [c.157]

    Н. Андерсон) рекомендуют использовать всю, очень стабильную совокупность белков сердца крысы. Подробно описана воспроизводимая процедура получения соответствующего гомогената. Его подмешивают к агарозе, которой заливают цилиндрик геля первого направления при фиксации его по торцу пластины второго направления. Равномерно распределенные по всей длине цилиндрика, белки сердца после электрофореза во втором направлении образуют на пластине ряд параллельных полос. 80 характерных полос этого набора пронумерованы от нижнего до верхнего края пластины. Они перекрывают щирокий диапазон молекулярных масс, так что с ними можно соотносить положе- [c.57]

    После электрофореза можно хранить гель на том же стекле, обернув его целлофаном, или предварительно перенести на металлическую фольгу. Можно положить на гель фильтровальную бумагу, которая хорошо к нему прилипает, и снять стекло. На этой же бумаге (после фиксации и окрашивания) гель можно и высушить. [c.35]

    В первоначальных экспериментах после завершения электрофореза гель во избежание диффузии полос ДНК в замороженном виде экспонировали на рентгеновскую пленку. Однако в этом случае присутствующие в геле вода и мочевина способствовали гашению радиоактивных сигналов и полосы ДНК на радиоавтографе получались нечеткими. Введенный впоследствии этап фиксации олигонуклеотидов в геле с помощью 10%-ной уксусной кислоты, кроме перевода нуклеиновых кислот в нерастворимую форму, удалял мочевину. Уже упоминавшийся выше маркерный краситель — бромфеноловый синий — является рН-ин-дикатором и в тех случаях, когда он не успевает выйти и остается в геле, по изменению его окраски с фиолетово-синей на желто-коричневую можно судить об изменении кислотности среды в самом геле. Последу- [c.184]

    По окончании электрофореза рекомендуется как можно быстрее провести фиксацию разделенных веществ путем их осаждения или высушивания, так как диффузия молекул продолжается и после отключения электрического тока, что приводит к ухудшению картины разделения. Бумагу и пленки из ацетата целлюлозы обычно высушивают, в случае же крахмального и полиакриламидного геля применяют осаждение разделенных веществ. Следует заметить, что пластины агарового и агарозного гелей, а также тонкие слои полиакриламидного геля тоже можно высушивать, но это, как правило, занимает много времени и, следовательно, нецелесообразно. [c.186]

    Для электрофореза в полиакриламидном геле используются разнообразные выпускаемые промышленностью и самодельные приборы. Мы предпочитаем те приборы, которые позволяют проводить разделение в тонких пластинах геля, что обеспечивает оптимальное разрешение. Лучшее разрешение на пластинах обусловлено тем, что возникающее во время электрофореза тепло здесь легко рассеивается, а также тем, что гель после электрофореза можно быстро фиксировать. Последнее важно для того, чтобы свести к минимуму диффузию белка в полосах. Пластины позволяют одновременно сравнивать много проб, и их легко сохранять после высушивания на листах фильтровальной бумаги. Радиоактивность в пробах выявляют радиоавтографией и фотофлюорографией, а высушенные на фильтровальной бумаге гели можно легко нарезать ножницами или резаком и после повторного насыщения водой вырезанных сухих полосок просчитывать на сцинтилляционном счетчике. Если не требуется большая разгонка в геле, электрофорез, фиксацию, окраску и высушивание успевают проводить за один день. [c.156]

    После электрофореза в присутствии ДДС-Ыа гель окрашивают, как обычно, например, в 0,25%-ном растворе СВВ К-250 (см. ниже) в 9%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% метанола, в течение нескольких часов при комнатной температуре, а затем отмывают в 7,5%-ной уксусной кислоте с 5% метанола и добавкой ионообменника АО 501×8 для связывания красителя. Фиксация белков идет одновременно с их окрашиванием. Однако следует иметь в виду, что ДДС-Ыа является эффективным детергентом и препятствует осаждению, а следовательно, и фиксации белков. Д я малых белков фиксация при окрашивании может оказаться ненадежной. Их лучше фиксировать предварительно, вымачивая гель в 10%-ной трихлоруксусной кисло-,те (ТХУ). ДДС-Ыа, находясь в комплексе с белком, еще и препятствует в некоторой мере самому процессу окрашивания. 10%-ная ТХУ частично отмывает белок от ДДС-Ыа. Еще лучше это можно делать, вымачивая гель в 50%-ном растворе ТХУ (в течение ночи). Изопропанол ускоряет вымывание ДДС-Ыа, поэтому его целесообразно включить в фиксирующий белки раствор. [c.64]

    Один из способов идентификации нужного фермента среди многих компонентов, разделившихся в процессе электрофореза, состоит в специфическом окрашивании этого фермента. Естественно, такой способ можно применять только в тех случаях, когда электрофорез проводят в неденатурирующих условиях и, следовательно, он не пригоден для выявления ферментов после электрофореза в присутствии мочевины или ДСН. Кроме того, процедуру идентификации фермента следует проводить без предварительной фиксации белковых полос, и тем не менее используемые реагенты должны успеть продиффундировать в гель прежде, чем произойдет диффузия самого фермента. Наиболее удовлетворительные результаты дают те методы, в которых гель разрезается по толщине на тонкие пластины (рис. 9.6), благодаря чему полосы белков оказываются на поверхности и необходимость в длительной диффузии реагентов в гель отпадает. Лучше всего для этого подходят крахмальные или полиакриламидные (толстые) пластины после проведения простого гель-электрофореза, электрофореза в градиентных гелях н изоэлектрического фокусирования. [c.327]

    Недавно было показано [Ja kie, 1978], что все эти трудности можно обойти путем кратковременной фиксации и окраски белковых полос в цилиндрике геля после ИЭФ таким образом, чтобы это не мешало последующему электрофорезу. По окончании ИЭФ по О Фарреллу белки фиксировали и окрашивали в течение 10 мин 0,1%-ным СВВ R-250 в растворе, содержащем 10% Hj OOH и 50% метанола. Отмывали гель 1 ч в том же растворителе, а затем в смеси, содержащей 7% СН,СООН, 5% метанола и 0,005% СВВ R-250 (последнее для предотвращения десорбции красителя с белка). Фиксированный таким образом цилиндрик геля можно хранить неделями. Перед фракционированием во втором направлении цилиндрик в течение 2 ч вымачивали в 5 мл раствора, содержащего 0,625 М Трис-НС1 (pH 6,5), 2,3% ДДС-Na, 5% -меркаптоэтанола и 10% глицерина, а далее проводили электрофорез так, как описано О Фарреллом. При выдерживании геля в 2,3%-ном ДДС-Na [c.48]

    Так, один из путей увеличения числа читаемых полос ДНК состоял в соответствующей подготовке полиакриламидного геля после завершения электрофореза к радиоавтофафии. Исключение диффузии фрагментов ДНК, достигаемое их фиксацией с помощью уксусной кислоты, и одновременное удаление мочевины позволили несколько повысить чувствительность и разрешающую способность метода. Более значительное улучшение было достигнуто путем удаления воды и экспонированием предварительно высушенного геля. [c.195]


Кокорин пожаловался адвокатам на ожог и загноение ноги после электрофореза в СИЗО

Фото: Максим Григорьев/ТАСС

Футболист Александр Кокорин заявил своим адвокатам, что после проведения электрофореза в следственном изоляторе у него на ноге возникли ожог и загноение, сообщает ТАСС.

Адвокаты Кокорина и Мамаева не смогли оспорить продление срока ареста Дело Кокорина и Мамаева

Адвокаты Кокорина и Мамаева не смогли оспорить продление срока ареста

«В следственном изоляторе нашему подзащитному Александру Кокорину около 10 дней назад врачи делали электрофорез и сожгли ему кожу и мышечную ткань на ноге. Саша пожаловался на загноение ноги», — рассказал агентству адвокат Андрей Ромашов.

Татьяна Стукалова, другой адвокат Кокорина, добавила, что защита просит «допустить к нему квалифицированных врачей».

В конце января уполномоченный по правам человека в Москве Татьяна Потяева сообщила, что футболист прошел медобследование, после чего было принято решение организовать для него курс реабилитации и лечебной физкультуры.

«У него до того, как он попал в СИЗО, была операция на ноге. Сейчас у него колено немного болит. (Начальник УФСИН РФ по Москве) Сергей Мороз поручил провести комплексное обследование его ноги и по итогам принять необходимые медицинские меры», — отмечала Потяева.

Выделите фрагмент с текстом ошибки и нажмите Ctrl+Enter

Лидаза инструкция по применению: показания, противопоказания, побочное действие – описание Lydase лиофилизат д/пригот. р-ра д/инъекц. и местн. прим. 64 УЕ: фл. 5 или 10 шт. (4383)

При рубцовых поражениях п/к (под рубцово-измененные ткани) или в/м (вблизи места поражения) вводят по 64 УЕ (1 мл) ежедневно или через день (всего 10-20 инъекций).

При травматических поражениях нервных сплетений и периферических нервов вводят п/к в область пораженного нерва (64 УЕ в растворе прокаина) через день; на курс — 12-15 инъекций. Курс лечения при необходимости повторяют.

При использовании в офтальмологической практике содержимое флакона растворяют в 20 мл воды для инъекций (0.1% раствор). Препарат вводят субконъюнктивально — 0.3 мл, парабульбарно — 0.5 мл, а также методом электрофореза.

Пациентам с туберкулезом легких с продуктивным характером воспаления назначают в комплексной терапии для повышения концентрации антибактериальных лекарственных средств в очагах поражения в виде инъекций и/или ингаляций. Ингаляции проводят ежедневно 1 раз/сут. Для проведения одной ингаляции содержимое флакона (64 УЕ) растворяют в 5 мл 0.9% раствора натрия хлорида. Курс лечения состоит из 20-25 ингаляций. При необходимости проводят повторные курсы с промежутками 1.5-2 мес.

Наружно, в виде повязок, пропитанных раствором препарата. Для приготовления раствора каждые 64 УЕ растворяют в 10 мл стерильного 0.9% раствора натрия хлорида или кипяченой воды комнатной температуры. Этим раствором смачивают стерильную повязку, сложенную в 4-5 слоев, накладывают ее на пораженный участок, покрывают вощеной бумагой и фиксируют мягкой повязкой. Повязку накладывают ежедневно на 15-18 ч в течение 15-60 дней. При длительном применении через каждые 2 недели делают перерыв на 3-4 дня.

При применении методом электрофореза 1 флакон препарата (64 УЕ) растворяют в 60 мл дистиллированной воды, добавляют 2-3 капли 0.1% раствора хлористоводородной кислоты и вводят с анода на пораженный участок в течение 20-30 мин. Курс лечения — 15-20 сеансов.

Аппликационный режим дозирования можно чередовать с электрофорезом.

Приготовленный раствор должен быть использован в течение 24 ч.

Addgene: Protocol — How to Run an Agarose Gel

  • Добавьте загрузочный буфер к каждому из ваших образцов ДНК.

  • Примечание: Загрузочный буфер служит двум целям: 1) он обеспечивает видимый краситель, который помогает с загрузкой геля и позволяет вам оценить, насколько далеко переместилась ДНК; 2) он содержит высокий процент глицерина, который увеличивает плотность вашего образца ДНК, заставляя его оседать на дно лунки геля вместо того, чтобы диффундировать в буфер.

  • После затвердевания поместите гель агарозы в контейнер для геля (блок для электрофореза).

  • Заполните коробку с гелем 1xTAE (или TBE), пока гель не покроется.

  • * Pro-Tip * Помните, если вы добавили EtBr в свой гель, добавьте немного в буфер. EtBr заряжен положительно и будет двигаться в противоположном направлении от ДНК. Таким образом, если вы запустите гель без EtBr в буфере, вы достигнете точки, в которой ДНК будет находиться в нижней части геля, но весь EtBr будет в верхней части, и ваши полосы будут различно интенсивными.Если это произойдет, вы можете просто замочить гель в растворе EtBr и промыть водой, чтобы выровнять окрашивание после нанесения геля, как если бы вы не добавляли EtBr в гель.

  • Осторожно загрузите лестницу молекулярной массы в первую полосу геля.

  • Примечание: При загрузке образца в лунку поддерживайте положительное давление на образец, чтобы предотвратить попадание пузырьков или буфера в наконечник.Поместите самый верхний конец наконечника пипетки в буфер прямо над лункой. Очень медленно и равномерно вытолкните образец наружу и наблюдайте, как образец заполняет лунку. После выгрузки всего образца нажмите пипетку до второго упора и осторожно поднимите пипетку прямо из буфера.

  • Осторожно загрузите образцы в дополнительные лунки геля.

  • Запустите гель при 80–150 В, пока линия окраски не пройдет примерно 75–80% пути вниз по гелю.Типичное время работы составляет около 1-1,5 часа, в зависимости от концентрации геля и напряжения.

  • Примечание: Черный — отрицательный, красный — положительный. ДНК заряжена отрицательно и будет двигаться к положительному электроду. Всегда бегать к красному.

  • Выключите питание, отсоедините электроды от источника питания, а затем осторожно удалите гель из контейнера с гелем.

  • (необязательно) Если вы не добавляли EtBr в гель и буфер, поместите гель в контейнер, наполненный 100 мл рабочего буфера TAE и 5 мкл EtBr, поместите на качалку на 20-30 минут, замените Раствор EtBr водой и обесцвечивать 5 мин.

  • С помощью любого устройства, имеющего УФ-свет, визуализируйте свои фрагменты ДНК. Фрагменты ДНК обычно называют «полосами» из-за их появления на геле.

  • * Pro-Tip * Если вы собираетесь очищать ДНК для дальнейшего использования, используйте длинноволновое УФ-излучение и экспонируйте как можно меньше времени, чтобы минимизировать повреждение ДНК.

    Примечание: При использовании УФ-излучения защищайте кожу, надев защитные очки или маску для лица, перчатки и лабораторный халат.

    Используя лестницу ДНК на первой полосе в качестве ориентира (в инструкции производителя указан размер каждой полосы), вы можете сделать вывод о размере ДНК на дорожках для образцов. Для получения дополнительных сведений о составлении диагностических обзоров и о том, как их интерпретировать, см. Страница диагностического дайджеста.

    Если вы проводите определенные процедуры, такие как молекулярное клонирование, вам необходимо очистить ДНК от агарозного геля. Чтобы узнать, как это сделать, посетите Страница «Очистка геля».

    Электрофорез в агарозном геле для разделения фрагментов ДНК

    Abstract

    Электрофорез в агарозном геле является наиболее эффективным способом разделения фрагментов ДНК различного размера от 100 п.о. до 25 т.п.н. 1 . Агароза выделена из водорослей родов Gelidium и Gracilaria и состоит из повторяющихся субъединиц агаробиозы (L- и D-галактоза) 2 . Во время гелеобразования полимеры агарозы нековалентно связываются и образуют сеть пучков, размер пор которых определяет свойства молекулярного сита геля.Использование электрофореза в агарозном геле произвело революцию в разделении ДНК. До внедрения агарозных гелей ДНК в первую очередь разделяли с использованием центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, что давало лишь приблизительный размер. Чтобы отделить ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле, ДНК загружают в предварительно залитые лунки геля и прикладывают ток. Фосфатный остов молекулы ДНК (и РНК) заряжен отрицательно, поэтому при помещении в электрическое поле фрагменты ДНК будут мигрировать к положительно заряженному аноду.Поскольку ДНК имеет однородное соотношение масса / заряд, молекулы ДНК разделены по размеру в агарозном геле в таком порядке, что пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму ее молекулярной массы 3 . Ведущей моделью движения ДНК через агарозный гель является «смещенная рептация», когда передний край движется вперед и тянет остальную часть молекулы вдоль 4 . Скорость миграции молекулы ДНК через гель определяется следующим: 1) размером молекулы ДНК; 2) концентрация агарозы; 3) конформация ДНК 5 ; 4) приложенное напряжение, 5) присутствие бромистого этидия, 6) тип агарозы и 7) буфер для электрофореза.После разделения молекулы ДНК можно визуализировать в ультрафиолетовом свете после окрашивания соответствующим красителем. Следуя этому протоколу, учащиеся должны уметь: 1. Понять механизм, с помощью которого фрагменты ДНК разделяются в гелевой матрице 2. Понять, как конформация молекулы ДНК будет определять ее подвижность через гелевую матрицу 3. Определить раствор агарозы подходящая концентрация для их нужд 4. Приготовьте агарозный гель для электрофореза образцов ДНК 5. Установите аппарат для гель-электрофореза и источник питания 6.Выберите подходящее напряжение для разделения фрагментов ДНК 7. Понять механизм, с помощью которого бромид этидия позволяет визуализировать полосы ДНК 8. Определить размеры разделенных фрагментов ДНК

    Ключевые слова: Генетика, Выпуск 62, Гель-электрофорез, агароза , Разделение ДНК, бромид этидия

    Протокол

    1. Приготовление геля

    1. Взвешивают соответствующую массу агарозы в колбу Эрленмейера. Гели агарозы готовят с использованием процентного раствора вес / объем.Концентрация агарозы в геле будет зависеть от размеров разделяемых фрагментов ДНК, причем большинство гелей находится в диапазоне от 0,5% до 2%. Объем буфера не должен превышать 1/3 вместимости колбы.

    2. Добавьте рабочий буфер в колбу, содержащую агарозу. Чтобы перемешать, покрутите. Наиболее распространенными буферами для прогрева геля являются ТАЕ (40 мМ трис-ацетат, 1 мМ EDTA) и TBE (45 мМ трис-борат, 1 мМ EDTA).

    3. Расплавьте смесь агарозы и буфера. Чаще всего это делается путем нагревания в микроволновой печи, но можно также сделать это и над пламенем Бунзена.С 30-секундными интервалами снимают колбу и перемешивают содержимое, пока оно хорошо перемешивается. Повторяйте до полного растворения агарозы.

    4. Добавьте бромид этидия (EtBr) до концентрации 0,5 мкг / мл. В качестве альтернативы, гель можно также окрашивать после электрофореза в рабочем буфере, содержащем 0,5 мкг / мл EtBr, в течение 15-30 минут с последующим обесцвечиванием в рабочем буфере в течение равного промежутка времени.

    Примечание: EtBr является предполагаемым канцерогеном и должен быть утилизирован в соответствии с правилами учреждения.При работе с гелями, содержащими EtBr, всегда следует носить перчатки. Доступны альтернативные красители для окрашивания ДНК; однако EtBr остается самым популярным из-за его чувствительности и стоимости.

    1. Дайте агарозе остыть либо на столе, либо путем инкубации на водяной бане с температурой 65 ° C. В противном случае лоток с гелем деформируется.

    2. Поместите лоток с гелем в литейный аппарат. В качестве альтернативы можно также заклеить открытые края лотка для геля, чтобы создать форму.Поместите соответствующую гребенку в гелевую форму, чтобы создать лунки.

    3. Залейте расплавленную агарозу в гелевую форму. Дайте агарозе остыть при комнатной температуре. Снимите гребешок и поместите гель в коробку для геля. Кроме того, гель можно завернуть в полиэтиленовую пленку и хранить при 4 ° C до использования ( Рис. 1 ).

    2. Установка гелевого аппарата и разделение фрагментов ДНК

    1. Добавьте краситель в образцы ДНК, которые нужно разделить ( Рис.2 ). Краситель с гелевой загрузкой обычно изготавливается с 6-кратной концентрацией (0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксилолцианола, 30% глицерина). Загрузка красителя помогает отследить, как далеко прошел образец ДНК, а также позволяет образцу погрузиться в гель.

    2. Запрограммируйте источник питания на желаемое напряжение (1-5 В / см между электродами).

    3. Добавьте достаточное количество рабочего буфера, чтобы покрыть поверхность геля. Важно использовать тот же рабочий буфер, который использовался для приготовления геля.

    4. Подсоедините провода коробки с гелем к источнику питания. Включите источник питания и убедитесь, что гелевый бокс и источник питания работают.

    5. Снимите крышку. Медленно и осторожно загрузите образец (ы) ДНК в гель ( рис. 3 ). Маркер подходящего размера ДНК всегда следует загружать вместе с экспериментальными образцами.

    6. Установите крышку на коробку с гелем. Катод (черные выводы) должен быть ближе к лункам, чем анод (красные выводы).Дважды проверьте, что электроды вставлены в правильные гнезда источника питания.

    7. Включите питание. Наносите гель, пока краситель не переместится на необходимое расстояние.

    3. Наблюдение за разделенными фрагментами ДНК

    1. После завершения электрофореза выключите источник питания и снимите крышку гелевого контейнера.

    2. Извлеките гель из контейнера с гелем. Слейте лишний буфер с поверхности геля. Поместите лоток для геля на бумажные полотенца, чтобы впитать лишний буферный раствор.

    3. Удалите гель из лотка для геля и подвергните гель воздействию ультрафиолета. Чаще всего это делается с помощью системы гель-документации ( Рис. 4 ). Полосы ДНК должны отображаться как оранжевые флуоресцентные полосы. Сделайте снимок геля ( рис. 5 ).

    4. Утилизируйте гель и рабочий буфер в соответствии с правилами учреждения.

    4. Типичные результаты

    Рисунок 5 представляет собой типичный результат после электрофореза в агарозном геле продуктов ПЦР.После разделения полученные фрагменты ДНК видны в виде четко определенных полос. Стандарт ДНК или лестницу следует разделять до такой степени, чтобы можно было эффективно определять размеры полос образца. В показанном примере фрагменты ДНК размером 765 п.н., 880 п.н. и 1022 п.н. разделяют на 1,5% агарозном геле вместе с 2-логарифмической лестницей ДНК.

    Рисунок 1. Затвердевший гель агарозы после удаления гребня.

    Рисунок 2. Студентка добавляет краситель к своим образцам ДНК.

    Рис. 3. Студент загружает образец ДНК в лунку геля.

    Рисунок 4. Пример системы документации геля.

    Рисунок 5. Изображение после электрофореза в геле. EtBr добавляли к гелю перед электрофорезом до конечной концентрации 0,5 мкг / мл с последующим разделением при 100 В в течение 1 часа. Гель подвергали воздействию ультрафиолетового света и снимали с помощью системы документирования геля.

    Обсуждение

    Электрофорез в агарозном геле оказался эффективным и действенным способом разделения нуклеиновых кислот.Высокая прочность геля агарозы позволяет работать с гелями с низким процентным содержанием для разделения больших фрагментов ДНК. Молекулярное просеивание определяется размером пор, создаваемых связками агарозы 7 в гелевой матрице. Как правило, чем выше концентрация агарозы, тем меньше размер пор. Традиционные агарозные гели наиболее эффективны при разделении фрагментов ДНК размером от 100 до 25 т.п.н. Чтобы разделить фрагменты ДНК размером более 25 т.п.н., необходимо использовать гель-электрофорез в импульсном поле 6 , который включает приложение переменного тока с двух разных направлений.Таким образом, фрагменты ДНК большего размера разделяются скоростью, с которой они переориентируются при изменении направления тока. Фрагменты ДНК размером менее 100 п.н. более эффективно разделяются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. В отличие от агарозных гелей, матрица полиакриламидного геля образуется в результате химической реакции, управляемой свободными радикалами. Эти более тонкие гели имеют более высокую концентрацию, работают вертикально и имеют лучшее разрешение. В современном секвенировании ДНК используется капиллярный электрофорез, при котором капиллярные трубки заполняются гелевой матрицей.Использование капиллярных трубок позволяет применять высокие напряжения, тем самым обеспечивая быстрое разделение фрагментов ДНК (и определение последовательности ДНК).

    Агароза может быть модифицирована для создания агарозы с низкой температурой плавления путем гидроксиэтилирования. Агароза с низкой температурой плавления обычно используется, когда требуется выделение разделенных фрагментов ДНК. Гидроксиэтилирование снижает плотность упаковки агарозных пучков, эффективно уменьшая размер их пор 8 . Это означает, что фрагменту ДНК того же размера потребуется больше времени, чтобы пройти через легкоплавкий агарозный гель, в отличие от стандартного агарозного геля.Поскольку пучки связываются друг с другом посредством нековалентных взаимодействий 9 , можно повторно расплавить гель агарозы после того, как он застынет.

    EtBr — наиболее распространенный реагент, используемый для окрашивания ДНК в агарозных гелях 10 . Под воздействием ультрафиолетового излучения электроны в ароматическом кольце молекулы этидия активируются, что приводит к высвобождению энергии (света), когда электроны возвращаются в основное состояние. EtBr работает, внедряясь в молекулу ДНК в зависимости от концентрации.Это позволяет оценить количество ДНК в любой конкретной полосе ДНК на основе ее интенсивности. Из-за его положительного заряда использование EtBr снижает скорость миграции ДНК на 15%. EtBr является подозреваемым мутагеном и канцерогеном, поэтому следует проявлять осторожность при обращении с агарозными гелями, содержащими его. Кроме того, EtBr считается опасными отходами и должен утилизироваться надлежащим образом. Альтернативные красители для ДНК в агарозных гелях включают SYBR Gold, SYBR green, Crystal Violet и Methyl Blue.Из них метиловый синий и кристально-фиолетовый не требуют воздействия на гель ультрафиолетового света для визуализации полос ДНК, тем самым снижая вероятность мутации, если требуется извлечение фрагмента ДНК из геля. Однако их чувствительность ниже, чем у EtBr. SYBR gold и SYBR green являются высокочувствительными УФ-зависимыми красителями с меньшей токсичностью, чем EtBr, но они значительно дороже. Более того, все альтернативные красители либо не работают, либо не работают при прямом добавлении в гель, поэтому гель необходимо будет подвергнуть последующему окрашиванию после электрофореза.Из-за стоимости, простоты использования и чувствительности EtBr по-прежнему остается предпочтительным красителем для многих исследователей. Однако в определенных ситуациях, например, когда удаление опасных отходов затруднено или когда молодые студенты проводят эксперимент, может быть предпочтительнее использовать менее токсичный краситель.

    Краски, используемые в гель-электрофорезе, служат трем основным целям. Сначала они увеличивают плотность образца, позволяя ему погрузиться в гель. Во-вторых, красители придают цвет и упрощают процесс загрузки. Наконец, красители перемещаются через гель со стандартной скоростью, что позволяет оценить расстояние, на которое мигрировали фрагменты ДНК.

    Точные размеры разделенных фрагментов ДНК можно определить, построив логарифм молекулярной массы для различных полос стандарта ДНК в зависимости от расстояния, пройденного каждой полосой. Стандарт ДНК содержит смесь фрагментов ДНК заранее определенного размера, которые можно сравнить с неизвестными образцами ДНК. Важно отметить, что разные формы ДНК проходят через гель с разной скоростью. Суперспиральная плазмидная ДНК из-за своей компактной конформации движется через гель быстрее всего, за ним следует линейный фрагмент ДНК того же размера, а открытая круглая форма движется медленнее всего.

    В заключение, с момента принятия агарозных гелей в 1970-х годах для разделения ДНК, он оказался одним из самых полезных и универсальных методов в исследованиях биологических наук.

    Как визуализировать белки после электрофореза

    Визуализация белков в геле, разделенных с помощью SDS-PAGE или 2-D гель-электрофореза, достигается окрашиванием гелей красителем, ионами металлов или флуоресцентными красителями. Различные методы окрашивания являются предпочтительными в зависимости от связывания красителя с белками в широком диапазоне, чувствительности к обнаружению белков с низким содержанием и последующего применения, необходимого для выделенного белка, подобного масс-спектрометрии.Иногда используются два метода окрашивания, так как одним методом окрашивания не удается достичь всего, что желает исследователь. Различные методы окрашивания для визуализации белков в геле заключаются в следующем. Красители Кумасси R-250 и G-250 связываются с белками стехиометрически через свои группы сульфоновой кислоты. Взаимодействия между красителем и белком являются ван-дер-ваальсовыми и ионными. Группы сульфоновой кислоты взаимодействуют с положительными аминогруппами. Поэтому краситель кумасси связывается с широким спектром белков. Наиболее часто используемый краситель R-250 может определять белок до 0.1 мкг. Кумасси бриллиантовый синий включает этап окрашивания и обесцвечивания, поскольку гель также становится синим. Кумасси бриллиантовый синий совместим с масс-спектрометрическим анализом. Хотя он широко используется для окрашивания гелей для просмотра белков, это не лучший метод, если требуется более высокая чувствительность. Для аналитических целей другие методы, такие как окрашивание серебром и флуоресцентное окрашивание, предпочтительнее классического окрашивания кумасси бриллиантовым синим. При коллоидном окрашивании кумасси краситель G-250 используется вместо R-250 из-за его коллоидных свойств.G-250 образует коллоидные частицы в спиртовых растворах, содержащих сильные кислоты и высокие концентрации солей 1, 2 . Образование коллоидных частиц G-250 снижает содержание свободного красителя в растворе, и, таким образом, краситель не проникает и не окрашивает гель. Этот шаг увеличивает чувствительность окрашивания белков и устраняет фоновое окрашивание гелей. При коллоидном окрашивании кумасси достигается предел обнаружения 1-10 нг белка в геле 3 . Он обеспечивает высокую чувствительность — менее 1 нг белка 4 .Ионы серебра связываются с белком и дополнительно восстанавливаются с помощью проявляющего раствора, чтобы получить изображение полос белка. Окрашивание серебром включает различные этапы, такие как фиксация белка, сенсибилизация, импрегнация серебром и проявление изображения. На основе используемого раствора существует два метода окрашивания серебром: нитрат серебра и метод аммиачно-серебряного комплекса. Доступны протоколы окрашивания серебром, совместимые с последующими приложениями, такими как масс-спектрометрия. Обратной стороной окрашивания серебром является то, что оно имеет ограниченный динамический диапазон и, следовательно, не взаимодействует равномерно со всеми белками.Кроме того, это связано с использованием опасных химикатов. Флуоресцентное окрашивание равномерно окрашивает белок, является быстрым и обеспечивает чувствительность, равную чувствительности, достигаемой методом окрашивания серебром. Он не включает стадии обесцвечивания и совместим с масс-спектрометрией и микросеквенированием. Имеются коммерческие флуоресцентные красители для окрашивания гелей 1D или 2D для визуализации полос. В методе визуализации белков без образования пятен 2, 2, 2-трихлорэтнаол добавляется к раствору полиакриламида перед отливкой геля 5 .Принцип бесцветного метода заключается в том, что аминокислоты триптофана в белке подвергаются индуцированной ультрафиолетовым светом реакции с тригалогенсодержащими соединениями, вызывая флуоресценцию в видимом диапазоне (300 нм). Этот метод быстрый, так как полосы на трансиллюминаторе можно увидеть в течение 5 минут, и он позволяет избежать пятен.

    Список литературы

    1. Neuhoff, V. и др. (1988). Электрофорез 9, 255-262
    2. Candiano, G. et al (2004). Электрофорез 25, 1327-1333
    3. Канг Д. и др. (2002). Бык. Korean Chem.Soc. 11, 1511-1512,
    4. Chevallet, M. et al (2006). Nat Protoc.1 (4): 1852-1858
    5. Ladner, C. L. et al (2004). Анальная биохимия. 1 марта 2004 г., 326 (1): 13-20

    Темы: Обнаружение белка

    Руководство по поиску и устранению неисправностей при электрофорезе нуклеиновых кислот

    | Thermo Fisher Scientific

    Возможные причины Рекомендации
    Препарат в виде геля
    Густой гель
    • Сохраняйте толщину геля около 3–4 мм при заливке горизонтальных агарозных гелей.Гели толщиной более 5 мм могут привести к диффузии полос во время электрофореза.
    Плохо сформированные скважины
    • Тщательно очистите гребешок для геля, прежде чем использовать его для заливки геля.
    • Во избежание протекания пробы через дно геля и размазывания полос пробы не проталкивайте гребенку до дна горизонтального геля.
    • Избегайте переполнения лотка для геля, так как это может привести к подключению лунок.
    • Перед тем, как снимать гребешок, подождите, пока сформировались лунки.
    • Когда гель затвердеет, осторожно и постепенно снимите гребешок, чтобы не повредить лунки.
    Неправильный тип геля
    • Для электрофореза одноцепочечных нуклеиновых кислот (например, РНК) приготовьте денатурирующий гель для эффективного разделения. С другой стороны, избегайте использования денатурирующих гелей с образцами двухцепочечной ДНК.
    Пробоподготовка
    Образец перегружен
    • Используйте не более необходимого количества образцов для гель-электрофореза; Обычно рекомендуется 0,1–0,2 мкг образца на миллиметр ширины лунки геля. Расплывчатые мазки, деформированные или U-образные полосы и полосы, которые кажутся сросшимися, являются обычными характеристиками перегруженных гелей.
    Деградированный образец
    • Убедитесь, что выбранные реагенты соответствуют требованиям молекулярной биологии и что лабораторное оборудование не содержит нуклеаз.Соблюдайте надлежащие лабораторные практики (например, надев перчатки, предотвращайте заражение нуклеазами, работайте в специально отведенных местах и ​​т. Д.) При работе с нуклеиновыми кислотами, особенно при работе с РНК.
    Образец в высокосолевом буфере
    • Убедитесь, что концентрация соли загрузочного буфера совместима с выбранным гелем. При необходимости разбавьте загрузочный буфер.
    • Если образец нуклеиновой кислоты уже находится в буфере с высоким содержанием соли, разбавьте образец водой, свободной от нуклеаз, перед добавлением загрузочного буфера.При необходимости очистите или осаждайте образец нуклеиновой кислоты и ресуспендируйте его в воде, свободной от нуклеаз, для удаления избытка соли.
    Образец, содержащий большое количество белка
    Несовместимый буфер загрузки
    • Для электрофореза одноцепочечных нуклеиновых кислот используйте краситель, содержащий денатурирующий агент, а затем нагрейте образец, чтобы предотвратить образование нежелательных дуплексов.
    • Для электрофореза двухцепочечной ДНК избегайте загрузки красителя денатурантом и не нагревайте образец, чтобы сохранить дуплексную структуру.
    Гель
    Пузыри, появившиеся во время загрузки образца
    • Убедитесь, что во время загрузки образца в лунку не попали пузырьки воздуха, чтобы избежать искажения полосы.
    Лунка повреждена при загрузке образца
    • Избегайте прокалывания лунок кончиками пипеток во время загрузки образца.
    Лунки для образцов, содержащие остаточный акриламид и / или мочевину
    • При использовании полиакриламидных гелей смывайте остаточный акриламид (и мочевину в случае денатурирующих гелей) из лунок перед загрузкой образца.
    Очень низкое или высокое напряжение
    • Подайте напряжение в соответствии с рекомендациями для диапазона размеров нуклеиновых кислот и используемого рабочего буфера.Очень низкое или высокое напряжение может привести к неоптимальному разрешению при разделении нуклеиновых кислот.
    Очень короткое или долгое время работы
    • Нанесите гель на достаточно долгое время, чтобы полосы полностью рассосались. Однако очень длительный цикл может вызвать чрезмерное нагревание, денатурировать образцы и привести к диффузии полос.
    Несовместимый рабочий буфер
    • Убедитесь, что буфер для приготовления геля и рабочий буфер совместимы и приготовлены правильно.
    • Используйте буфер с высокой буферной емкостью для электрофореза более 2 часов.
    Образец визуализации
    Ленточная диффузия
    • Избегайте хранения геля или большой задержки между завершением электрофореза и визуализацией геля. Полосы меньшего размера молекул, а также окрашивание нуклеиновой кислоты, включенное в гель, могут стать диффузными.
    Совместно мигрирующие ленты
    • Используйте соответствующий процент геля, напряжение и время анализа для разделения полос с одинаковыми размерами молекул.Коломигрирующие полосы часто выглядят как диффузная, толстая и яркая.
    Камера вне фокуса
    • Убедитесь, что камера находится в фокусе, если гель просматривается через линзу для отображения на экране.

    Окрашивание и визуализация белков после двухмерного электрофореза | ЛСР

    ru-ruLUSQN83Q3Визуализация — сохранение — окрашивание и визуализация белков после двумерного электрофореза / webroot / web / html / lsr / solutions / technologies / 2d_electrophoresis

    После двумерного электрофореза белки визуализируются посредством окрашивания в геле.Тип используемого красителя зависит от условий и целей вашего эксперимента. и последующие приложения.

    Независимо от того, на что вы ориентируетесь: на чувствительность или пропускную способность, у Bio-Rad всегда есть пятна доступны для удовлетворения любого набора требований эксперимента. Из популярного Биобезопасность и торговля; Coomassie Blue Stain для более чувствительных Oriole™ Gel Stain , продукты для визуализации от Bio-Rad, гарантируют правильное определение белка и анализ. Кроме того, Bio-Rad предлагает аксессуары для облегчения работы с большие или хрупкие гели в процессе окрашивания, такие как Dodeca & trade; Краски , которые предназначены для воспроизводимого окрашивания до 12 гелей за раз.

    В этом разделе представлены рекомендации по обнаружению белков в гелях с использованием различных белковые красители и красители от Bio-Rad. Он также предоставляет протоколы для общего белка. окрашивание.

    Связанные темы : Изображения и анализ гелей для двумерного электрофореза , белок Точечное удаление и идентификация белка , Устранение неполадок Гели для 2-D электрофореза с 2-D Doctor & trade; , белок Подготовка образцов для двумерного электрофореза , сначала Разделение измерений (изоэлектрическая фокусировка) и второе измерение Расставание .

    Рекомендации по обнаружению белков в гелях

    Руководство по выбору пятен Биологически безопасное пятно кумасси G-250 Набор для окрашивания серебра Кумасси синий краситель R-250 Набор Коллоидный кумасси QC Набор для окрашивания серебра Dodeca GS-900

    Визуализация на основе ПЗС Система визуализации на основе ПЗС Без пятен Система визуализации на основе ПЗС SYPRO Ruby Protein Gel Stain Флуоресцентный гель-краситель иволги Набор для окрашивания серебра Dodeca Набор Набор для окрашивания серебра Коллоидный кумасси QC Кумасси синий краситель R-250 Биологически безопасное пятно кумасси G-250

    Гели используются для аналитических или препаративных целей.Предполагаемое использование гель определяет количество загружаемого белка и средства обнаружения. это чаще всего делают белки в гелях видимыми, окрашивая их красителями или металлами. Каждый тип белкового красителя имеет свои особенности и ограничения в отношении чувствительности обнаружения и типов белков, которые лучше всего окрашивают. Иногда белки переносятся на мембраны с помощью западного блоттинг для выявления с помощью иммуноблоттинга или окрашивания общего белка.Вестерн-блоттинг 2-D гелей часто используется для анализа посттрансляционных модификаций.

    Если целью гель-электрофореза является определение белков с низким содержанием белок в клеточном экстракте или загрязняющие вещества в схеме очистки), затем высокий белок нагрузка (0,1 & ndash; 1 мг / мл) и высокочувствительное пятно, например серебряное или флуоресцентное пятно, следует использовать.Когда целью является получение достаточного количества белка для использования в качестве антиген или для анализа последовательности, тогда следует приложить высокую белковую нагрузку к гель и белки, визуализированные с помощью процедуры окрашивания, которая не фиксирует белки в геле. Количественные сравнения требуют использования красок с широким линейным диапазоном. обнаружения.

    Достижимая чувствительность при окрашивании определяется:

    • количество красителя, которое связывается с белками
    • интенсивность окраски
    • разница в окраске окрашенных белков и остаточного фона в теле геля (отношение сигнал / шум)

    Несвязанные молекулы пятен можно вымыть из гелей без значительного удаления пятен. из белков.

    Белки по-разному взаимодействуют с пятнами. Белковое пятно, которое можно визуализировать при использовании одного протокола окрашивания может быть не видно при применении другого окрашивания. Поэтому важно оценивать эффективность нескольких пятен с каждым новым. пробы и выберите пятна, дающие наилучшие результаты. Все пятна по-разному взаимодействуют с разными белками.Ни одно пятно не окрашивает все белки в геле в пропорционально их массе. Единственное наблюдение, которое справедливо для большинства пятен в том, что они лучше всего взаимодействуют с основными аминокислотами. Для критического анализа реплицируйте гели должны быть окрашены двумя или более разными пятнами.

    Из всех доступных красителей коллоидный кумасси синий ( QC Коллоидный кумасси ), по-видимому, окрашивает самый широкий спектр белков.это поучительно, особенно с гелями 2-D PAGE, для окрашивания коллоидного окрашенного кумасси синим гель с серебром или окрашивание флуоресцентно окрашенного геля коллоидным кумасси синим или серебро. Очень часто эта процедура двойного окрашивания показывает несколько отличий. между белками. Чаще всего сначала окрашивают гели кумасси. Голубое или флуоресцентное пятно, а затем покрасьте его серебром.Однако порядок, в котором Используемые пятна кажутся не важными, если гели вымыты хорошо промойте водой высокой степени очистки между пятнами.

    Серебро пятна очень чувствительны; однако они имеют ограниченный динамический диапазон и не реагируют со всеми белками равномерно.Более чувствительный Фламинго и торговля; Флуоресцентный гель-краситель идеально подходит для неспецифической визуализации и количественного анализа. белков в гелях SDS-PAGE. Он использует простой двухэтапный протокол, который можно выполнить всего за 5 часов и не требует обесцвечивания.Шаги не зависят от времени и краситель не перекрашивает гели. Фламинго подходит для использования с высокопроизводительными лазерные системы визуализации. Иволга Флуоресцентный гель-краситель — это простой в использовании, быстрый, чувствительный и высоколинейный протеин. гель-краситель для визуализации и количественного определения белков в гелях SDS-PAGE.Простой протокол требует одноэтапного окрашивания без предварительной фиксации. С разрушения не требуется, образцы белка могут быть точно визуализированы и количественно оценены менее чем 2 часа. Характеристики возбуждения и излучения Oriole Stain делают его идеально подходит для УФ-формирователей изображений, таких как ChemiDoc & trade; Системы визуализации и Gel Doc & trade; гель системы документации .

    Запатентованная компания Bio-Rad не оставляет пятен технология визуализации позволяет визуализировать белковые гели и ботов без окрашивания. шаг. Bio-Rad предлагает сборный железобетон в мини- и миди-форматах. гели и растворы акриламида , содержащие уникальное соединение, не оставляющее пятен обнаружение белков.Нет необходимости в разрушающем шаге, а визуализацию можно сделано за 5 минут. Чувствительность изображения без пятен сравнима с чувствительностью Кумасси.

    Сканеры Bio-Rad без образования пятен ( ChemiDoc & trade; MP , ChemiDoc & trade; , ChemiDoc & trade; XRS + , Gel Doc & trade; XR + и Gel Doc & trade; EZ Systems) поставляются с автоматизированными программное обеспечение для визуализации и анализа и дает меньше информации по сравнению с традиционным Кумасси процедуры окрашивания, тем самым уменьшая вариабельность между гель-блотами и внутри них.

    Белковые пятна

    Посетите белковые пятна страницу, чтобы узнать больше о различных типах белковых красителей для гелей SDS-PAGE, изображенных на рисунке. ниже и выберите лучшую окраску для вашего приложения, а также ознакомьтесь с Protein На странице «Обнаружение и визуализация блоттинга» представлена ​​информация о окрашивании и других методах. для обнаружения белков на Вестерн-блоттинге.

    Пятна фламинго Пятна иволги Кумасси синие пятна Серебряные пятна SYPRO Stains Пятна без пятен

    Красители

    Dodeca Stainers

    Окрашивание обычно можно проводить в лотке, но при окрашивании большого количества из гелей наиболее эффективно использовать красители для гелей, такие как Dodeca & trade; Stainers , в которых можно одновременно разместить до 12 широкоформатных гелей.В Красители Dodeca совместимы с Bio-Safe Coomassie Stain, Coomassie Blue R-250. краситель, краситель SYPRO Ruby Protein Gel Stain, флуоресцентный гель-краситель Oriole, флуоресцентный Flamingo Гелевое окрашивание и набор для окрашивания серебра Dodeca.

    Совместимость красителей с гелями разного размера

    & nbsp; Размер геля (Ш x Д) Формат геля
    Большой краситель Dodeca 25 x 20.5 см PROTEAN & reg; Плюс ручная передача
    (требуется одно приложение на лоток)
    Малый краситель Dodeca 20 x 20,5 см Ручная трансляция PROTEAN Plus
    18.5 х 20 см PROTEAN II XL ручная литье
    13,3 x 8,7 см Критерий
    (до 24 гелей, требуется одна насадка на лоток)
    Протоколы
    Число Описание Параметры
    6209 Общее окрашивание протеином Нажмите, чтобы загрузить
    2895 Руководство по блоттингу белков, версия C2895 / webroot / web / pdf / lsr / Literature / Bulletin_2895.pdf комплекс антител, щелочная фосфатаза (AP), таблетки нитросинего тетразолия (NBT), BCIP, датчик вторичных антител, амидочерный, стрептавидин-биотин, анионный краситель, пятно для блоттинга общего белка, нитроцеллюлоза, подложка нитроцеллюлоза или поливинилидендифторид (ПВДФ) или низкофлуоресцентные мембраны ПВДФ LF, антитело, иммуноглобулин (IgG), антиген, анализ, авидин, биотин, фон, неспецифический шум, буфер Бьеррума Шафера-Нильсена, блокирующий реагент, вестерн-блоттинг, BLOTTO, хемилюминесценция, коллоидное золото, реагент для проявления цвета, колориметрическое обнаружение, хемилюминесцентное обнаружение, конъюгат фермент-антитело, краситель кумасси синий, диаминобензидин (DAB), дот-блот, буфер Данна, электрофоретический блоттинг, поролоновые подушечки, фильтровальная бумага, желатин, высокоинтенсивный перенос, иммуноанализ, иммуноблоттинг, иммунодетекция, лиганд, мембрана, сэндвичи с мембраной / фильтровальной бумагой, микрофильтрация, блоттинг, мультиплексирование, мультиэкран аппарат, нативный PAGE, электрофорез в полиакриламидном геле, NHS-биотин, неферментативный зонд, неферментативный зонд, обезжиренное сухое молоко, неспецифическое связывание, фикобилипротеин, источник питания, первичные антитела, предварительно окрашенные стандарты, маркеры молекулярной массы или лестницы, протеин A, протеин G, быстрый полусухой блоттинг, SDS-PAGE, додецилсульфат натрия, додецилсульфат натрия, отношение сигнал / шум, отношение сигнал / шум, Без пятен технология, ПЗС-сканер, устройство с зарядовой связью, StrepTactin, последовательность Strep-tag, субстрат, змеевик суперохлаждения, промокание резервуара, буфер Towbin, Tween 20 26512-D Практическое руководство по рабочему процессу электрофореза, ред. F2651 / webroot / web / pdf / lsr /rature / Bulletin_2651.pdfЛитератураPDFManuals_and_Quick_Guides / webroot / web / images / general / icons / icon_pdf.gif2-D Практическое руководство по рабочему процессу электрофореза №2-D Практическое руководство по рабочему процессу электрофореза, Rev F2651proteomics, бюллетень 2651, двухмерный электрофорез IT2651, двухмерный электрофорез 2-й, аналитический, протеомеры, префракционирование, 2-е руководство, 2-е руководство, 2-й электрофорез рабочий процесс, двухмерные методы и продукт, двухмерное руководство, двухмерное руководство, двухмерный рабочий процесс электрофореза, 2d методы и продукт Life Science Research / Продукция / Электрофорез и блоттинг / Электрофорез белков и блоттинг / 2D-электрофорез / 2-мерные системы электрофореза в формате Midi / Criterion Сотовые системы -> MT :: ea2c7559-109f-487c-b42f-f092db936ff3 ## Life Science Research / Products / Электрофорез и блоттинг / белковый электрофорез и блоттинг / высокопроизводительные гелевые красители Dodeca -> MT :: bee322bb-2816-4551-a1d6-a33f7c1c4f49 ## Life Science Research / Products / Электрофорез и блоттинг / белковый электрофорез и блоттинг / белковые пятна / пятна кумасси -> MT :: 2ef88af8-1ca6-44ef-9702-3ebcfe0ad35b ## Life Science Research / Products / Electrophoresis и блоттинг / белковый электрофорез и блоттинг / белковые пятна / флуоресцентные пятна -> MT :: cb886820-1f6e-447f-8ef6-772fd81c29e3 ## Life Science Research / Products / Электрофорез и блоттинг / белковый электрофорез и блоттинг / белковые пятна / серебряные пятна -> MT :: 09c4382c-f801-4c0a-827b-ac972ced3969 ## Карен Мосс Выделение и визуализация белков после двумерного электрофореза Узнайте о рекомендациях по обнаружению белков в гелях с использованием различных белков. красители и красители от Bio-Rad.Он также предоставляет протоколы для общего окрашивания белка. 2-й, 2-й, электрофорез, окрашивание, визуализация 22/12/11 13:24 01/28/35 02:00 PMAE, AI, AL, AM, AR, AT, AU, AZ, BA, BD, BE, BF, BG, BH, BN, BO, BR, BW, CA, CH, CL, CM, CN, CO, CR, CY, CZ, DE, DK, DO, DZ, EC, EE, EG, EH, ER, ES, ET, FI, FM, FO, FR, GA, GE, GF, GH, GP, GR, GT, GU, HK, HN, HR, HT, HU, ID, IE, IL, IN, IS, IT, JM, JO, JP, KE, KH, KR, KW, KZ, LB, LI, LK, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, ML, MO, MQ, MS, MT, MU, MX, MY, NG, NI, NL, NO, NP, NZ, OM, PA, PE, PF, PG, PH, PK, PL, PR, PS, PT, PW, PY, QA, RO, RS, RU, SA, SB, SE, SG, SI, SK, SN, ST, SV, TG, TH, TN, TO, TR, TT, TW, TZ, UA, UG, UK, US, UY, UZ, VA, VE, VU, XK, YE, ZA, VNenLSR / LSR / Technologies / 2-D_ElectrophoresisN0 Исследования в области биологии / Решения / Приложения / 2-D электрофорез и анализ -> МТС :: LUSQF04EH ## Исследования в области наук о жизни / Решения / Технологии / Белковый электрофорез -> МТС :: LUSOVO47B ## Life Science Research / Решения / Технологии / Белковый электрофорез / Белки Обнаружение и анализ / окрашивание белков -> MTS :: LUSPMPE8Z ## Исследования в области наук о жизни / Решения / Технологии / Визуализация и анализ -> MTS :: LUSQC6MNI ## Life Science Research / Решения / Технологии / Вестерн-блоттинг -> МТС :: LUSPPAKG4 ## Исследования в области наук о жизни / Решения / Приложения / Двухмерный электрофорез и анализ -> МТС :: LUSQF04EH ## Исследования в области наук о жизни / Решения / Технологии / Белковый электрофорез -> МТС :: LUSOVO47B ## Life Science Research / Решения / Технологии / Белковый электрофорез / Белки Обнаружение и анализ / окрашивание белков -> MTS :: LUSPMPE8Z ## Исследования в области наук о жизни / Решения / Технологии / Визуализация и анализ -> MTS :: LUSQC6MNI ## Life Science Research / Решения / Технологии / Вестерн-блоттинг -> МТС :: LUSPPAKG4 ## 02-D Электрофорез / ru-ru / Applications-Technologies / окрашивание-визуализация-белков-после-2-d-электрофореза? ID = LUSQG6LPT

    После двумерного электрофореза белки визуализируются путем окрашивания в геле.Тип используемого красителя зависит от условий и целей вашего эксперимента и последующих применений.

    Независимо от того, является ли ваша цель чувствительностью или пропускной способностью, компания Bio-Rad предлагает ряд красителей для удовлетворения любых требований эксперимента. Продукты для визуализации Bio-Rad, от популярного Bio-Safe ™ Coomassie Blue Stain до более чувствительного гелевого красителя Oriole ™, обеспечивают правильное обнаружение и анализ белка. Кроме того, Bio-Rad предлагает дополнительные продукты для облегчения работы с большими или хрупкими гелями в процессе окрашивания, такие как красители Dodeca ™, которые разработаны для воспроизводимого окрашивания до 12 гелей за раз.

    В этом разделе представлены инструкции по обнаружению белков в гелях с использованием различных белковых красителей и красителей от Bio-Rad. Он также предоставляет протоколы для общего окрашивания белка.

    Связанные темы : Визуализация и анализ гелей для двумерного электрофореза, удаление белковых пятен и идентификация белков, устранение неисправностей в гелях для двумерного электрофореза с помощью 2-D Doctor ™, подготовка образцов белка для двумерного электрофореза, разделение по первому измерению (изоэлектрическое Фокусировка) и разделение во втором измерении.

    Гели

    используются либо для аналитических, либо для препаративных целей. Предполагаемое использование геля определяет количество загружаемого белка и способы обнаружения. Чаще всего белки в гелях делают видимыми, окрашивая их красителями или металлами. Каждый тип белкового красителя имеет свои особенности и ограничения в отношении чувствительности обнаружения и типов белков, которые лучше всего окрашивают. Иногда белки переносятся на мембраны с помощью вестерн-блоттинга, чтобы их можно было обнаружить с помощью иммуноблоттинга или окрашивания общего белка.Вестерн-блоттинг 2-D гелей часто используется для анализа посттрансляционных модификаций.

    Если целью гель-электрофореза является определение белков с низким содержанием (белок с низким уровнем экспрессии в клеточном экстракте или контаминанты в схеме очистки), тогда высокая белковая нагрузка (0,1–1 мг / мл) и высокочувствительное окрашивание , например серебро или флуоресцентный краситель. Когда цель состоит в том, чтобы получить достаточно белка для использования в качестве антигена или для анализа последовательности, тогда необходимо приложить высокую белковую нагрузку к гелю и визуализировать белки с помощью процедуры окрашивания, которая не фиксирует белки в геле.Количественные сравнения требуют использования пятен с широким линейным диапазоном обнаружения.

    Достигаемая чувствительность при окрашивании определяется по:

    • количество красителя, которое связывается с белками
    • интенсивность окраски
    • разница в окраске окрашенных белков и остаточного фона в теле геля (отношение сигнал / шум)

    Несвязанные молекулы красителя могут быть вымыты из гелей без значительного удаления красителя с белков.

    Белки различаются по своему взаимодействию с пятнами. Белковое пятно, которое можно визуализировать с помощью одного протокола окрашивания, может быть не видно при применении другого окрашивания. Поэтому важно оценивать эффективность нескольких пятен с каждым новым образцом и выбирать пятна, дающие наилучшие результаты. Все красители по-разному взаимодействуют с разными белками. Ни один краситель не окрашивает все белки в геле пропорционально их массе. Единственное наблюдение, которое, по-видимому, справедливо для большинства красителей, заключается в том, что они лучше всего взаимодействуют с основными аминокислотами.Для критического анализа дубликаты гелей должны быть окрашены двумя или более разными пятнами.

    Из всех доступных красителей коллоидный кумасси синий (QC Colloidal Coomassie), по-видимому, окрашивает самый широкий спектр белков. Поучительно, особенно для гелей 2-D PAGE, окрашивать коллоидный гель, окрашенный кумасси синим, серебром или окрашивать флуоресцентно окрашенный гель коллоидным кумасси синим или серебром. Очень часто эта процедура двойного окрашивания выявляет некоторые различия между белками.Чаще всего сначала окрашивают гели кумасси синим или флуоресцентным красителем, а затем снова окрашивают серебром. Однако порядок, в котором используются пятна, не имеет значения, если гели хорошо промываются водой высокой чистоты между пятнами.

    Серебряные пятна очень чувствительны; однако они имеют ограниченный динамический диапазон и не реагируют одинаково со всеми белками. Более чувствительный флуоресцентный гель-краситель Flamingo ™ идеально подходит для неспецифической визуализации и количественного определения белков в гелях SDS-PAGE.Он использует простой двухэтапный протокол, который может быть выполнен всего за 5 часов и не требует обесцвечивания. Шаги не зависят от времени, и краситель не будет перекрашивать гели. Flamingo подходит для использования с высокопроизводительными лазерными системами визуализации. Флуоресцентный гель-краситель Oriole — это простой в использовании, быстрый, чувствительный и высоколинейный белковый гель-краситель для визуализации и количественного определения белков в гелях SDS-PAGE. Простой протокол требует одноэтапного окрашивания без предварительной фиксации.Поскольку обесцвечивание не требуется, образцы белка можно точно визуализировать и количественно оценить менее чем за 2 часа. Характеристики возбуждения и излучения Oriole Stain делают его идеальным для УФ-формирователей изображений, таких как системы визуализации ChemiDoc ™ и системы документирования гелей Gel Doc ™.

    Запатентованная технология визуализации без образования пятен

    Bio-Rad позволяет визуализировать белковые гели и боты без этапа окрашивания. Компания Bio-Rad предлагает готовые гели мини- и миди-формата и растворы акриламида, содержащие уникальное соединение, обеспечивающее обнаружение белка без образования пятен.Нет необходимости в обесцвечивании, а визуализацию можно сделать в течение 5 минут. Чувствительность визуализации без пятен сравнима с чувствительностью кумасси.

    Устройства формирования изображений

    Bio-Rad без образования пятен (ChemiDoc ™ MP, ChemiDoc ™, ChemiDoc ™ XRS +, Gel Doc ™ XR + и Gel Doc ™ EZ Systems) поставляются с автоматизированным программным обеспечением для визуализации и анализа и дают меньше фона по сравнению с традиционными процедурами окрашивания Кумасси , тем самым уменьшая вариабельность между гель-блотами и внутри них.

    Посетите страницу белкового окрашивания, чтобы узнать больше о различных типах белковых пятен для гелей SDS-PAGE, изображенных ниже, и выбрать лучшее пятно для вашего применения, а также посетите страницу Protein Bloting Detection and Imaging для получения информации о окрашивании и других методах обнаружения белки на вестерн-блоттинге.

    Dodeca Stainers

    Окрашивание обычно можно проводить в лотке, но при окрашивании большого количества гелей наиболее эффективно использовать красители для гелей, такие как Dodeca ™ Stainers, которые могут одновременно обрабатывать до 12 крупноформатных гелей. Красители Dodeca совместимы с биологически безопасным красителем Coomassie Stain, красителем Coomassie Blue R-250, красителем SYPRO Ruby Protein Gel Stain, флуоресцентным гелевым красителем Oriole, флуоресцентным гелевым красителем Flamingo и набором Dodeca Silver Stain Kit.

    Совместимость красителей с гелями разного размера

    Размер геля (Ш x Д) Формат геля
    Большой краситель Dodeca 25 x 20,5 см PROTEAN ® Plus ручное литье
    (требуется одна насадка на лоток)
    Малый краситель Dodeca 20 x 20,5 см PROTEAN Plus ручное литье
    18.5 x 20 см PROTEAN II XL ручное литье
    13,3 x 8,7 см Criterion
    (до 24 гелей, требуется одна насадка на лоток)

    Гель-электрофорез — Science Learning Hub

    Гель-электрофорез используется для разделения макромолекул, таких как ДНК, РНК и белки. Фрагменты ДНК разделяются по размеру. Белки можно разделить по размеру и заряду (разные белки имеют разные заряды).

    Как разделяются фрагменты ДНК с помощью гель-электрофореза?

    Раствор молекул ДНК помещается в гель. Поскольку каждая молекула ДНК заряжена отрицательно, ее можно протянуть через гель электрическим полем. Небольшие молекулы ДНК движутся через гель быстрее, чем более крупные молекулы ДНК.

    Результатом является серия «полос», каждая из которых содержит молекулы ДНК определенного размера. Полосы, наиболее удаленные от начала геля, содержат мельчайшие фрагменты ДНК.Ближайшие к началу геля полосы содержат наиболее крупные фрагменты ДНК.

    Когда гель-электрофорез используется для разделения фрагментов ДНК?

    Гель-электрофорез можно использовать для различных целей, например:

    Когда гель-электрофорез используется для разделения белков?

    Благодаря телешоу, таким как CSI, многие люди знакомы с использованием гель-электрофореза для разделения макромолекул, таких как ДНК. Однако гель-электрофорез также можно использовать для разделения белков.

    Различные белки имеют разные размеры, в основном из-за количества аминокислотных строительных блоков в их структуре. Химические модификации, связанные с белком, также влияют на его размер. У разных белков также разные заряды. Это может быть результатом как типов аминокислот, используемых для их создания, так и типов присоединенных к ним модификаций.

    Для получения различной информации используются разные типы гелей для электрофореза. Поэтому тип геля, который вы выбираете, зависит от типа задаваемого вами вопроса.

    Разделение по размеру

    Обычно гели, изготовленные из полиакриламида, используются для разделения белков на основе их различных размеров. Обычно белки сначала обрабатывают теплом и химическим веществом, называемым SDS, чтобы распутать белок. SDS — это детергент, который придает всем белкам одинаковый общий отрицательный заряд, поэтому при приложении электрического тока к гелю разделение происходит только из-за размера белка. Этот метод называется SDS-PAGE (электрофорез в SDS-полиакриламидном геле).

    Небольшие белковые молекулы проходят через гель быстрее, чем более крупные белки, что приводит к появлению серии «полос». Каждая полоса содержит белок определенного размера. Их можно сравнить со стандартами известных размеров.

    Гель SDS-PAGE использовался для разделения белков по размеру. Образцы крови различных видов акул. Первая полоса содержит маркеры известных размеров. Крупные белки находятся наверху геля, а мелкие — внизу.

    Этот метод может использоваться для многих целей, включая очистку определенного белка, например, для выделения фермента для пищевой промышленности.

    Зарядка и разделение pH

    Изоэлектрическое фокусирование (IEF) и электрофорез в агарозном геле — это два способа разделения белков с помощью их различных электрических зарядов. В отличие от SDS-PAGE, белки обычно сохраняются в своем естественном (свернутом) состоянии. Тип используемого геля и раствор вокруг геля также различаются.

    При электрофорезе в агарозном геле белки загружают в середину лунки. Белки с сильным отрицательным зарядом быстрее всего движутся к положительной стороне геля, тогда как положительно заряженные белки движутся в противоположном направлении.

    Этот метод может использоваться для разделения белков с одинаковой молекулярной массой, но с разными зарядами, или когда размер не важен (например, для изучения изменений в присутствии разных белков во время развития заболевания).

    Двумерный электрофорез

    В наши дни разделение заряда (IEF) и размера (SDS-PAGE) часто используется вместе в двумерном электрофорезе, где сначала используется разделение зарядов, а затем эти разделенные белки разделяются на основе по размеру.

    Это очень эффективный метод идентификации конкретного белка из ткани, которая может содержать тысячи белков и где могут быть только небольшие различия между контрольными и обработанными образцами (например, для поиска белка, участвующего в устойчивости растений к хищничеству насекомых. ).

    Визуализация и характеристика ДНК, РНК и белков

    Цели обучения

    • Объясните использование зондов нуклеиновых кислот для визуализации конкретных последовательностей ДНК
    • Объяснить использование гель-электрофореза для разделения фрагментов ДНК
    • Объясните принцип анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и его использование
    • Сравнить и сопоставить Саузерн-блоттинг и Нозерн-блоты
    • Объясните принципы и способы использования микроматричного анализа
    • Описать методы, используемые для разделения и визуализации вариантов белка
    • Объяснить метод и использование полимеразной цепной реакции и секвенирования ДНК

    Последовательность молекулы ДНК может помочь нам идентифицировать организм по сравнению с известными последовательностями, хранящимися в базе данных.Последовательность также может рассказать нам кое-что о функции определенной части ДНК, например, кодирует ли она определенный белок. Сравнение белковых сигнатур — уровней экспрессии определенных наборов белков — между образцами — важный метод оценки клеточных реакций на множество факторов окружающей среды и стрессов. Анализ белковых сигнатур может выявить личность организма или то, как клетка реагирует на заболевание.

    Интересующие нас ДНК и белки являются микроскопическими и обычно смешиваются со многими другими молекулами, включая ДНК или белки, не относящиеся к нашим интересам.Было разработано множество методов для выделения и характеристики интересующих молекул. Эти методы изначально были разработаны для исследовательских целей, но во многих случаях они были упрощены до такой степени, что стало возможным рутинное клиническое использование. Например, многие патогены, такие как бактерия Helicobacter pylori , вызывающая язв желудка , могут быть обнаружены с помощью тестов на основе белков. Кроме того, все большее количество высокоспецифичных и точных анализов идентификации на основе амплификации ДНК теперь может обнаруживать патогены, такие как устойчивые к антибиотикам кишечные бактерии, вирус простого герпеса , вирус ветряной оспы и многие другие.

    Молекулярный анализ ДНК

    В этом подразделе мы опишем некоторые из основных методов, используемых для разделения и визуализации определенных фрагментов ДНК, представляющих интерес для ученого. Некоторые из этих методов не требуют знания полной последовательности молекулы ДНК. До появления быстрого секвенирования ДНК эти методы были единственными доступными для работы с ДНК, но они по-прежнему составляют основной арсенал инструментов, используемых молекулярными генетиками для изучения реакции организма на микробные и другие заболевания.

    Зонд нуклеиновых кислот

    молекул ДНК маленькие, и информация, содержащаяся в их последовательности, невидима. Как исследователь выделяет определенный участок ДНК или, изолировав его, определяет, из какого он организма, какова его последовательность или какова его функция? Один из методов определения наличия определенной последовательности ДНК использует искусственно созданные фрагменты ДНК, называемые зондами. Зонды можно использовать для идентификации различных видов бактерий в окружающей среде, и теперь доступно множество ДНК-зондов для обнаружения патогенов клинически.Например, ДНК-зонды используются для обнаружения вагинальных патогенов Candida albicans , Gardnerella vaginalis и Trichomonas vaginalis .

    Чтобы проверить геномную библиотеку на предмет определенного гена или последовательности, исследователи должны что-то знать об этом гене. Если у исследователей есть часть последовательности ДНК для интересующего гена, они могут разработать ДНК-зонд , одноцепочечный фрагмент ДНК, который комплементарен части интересующего гена и отличается от других последовательностей ДНК в образце. .ДНК-зонд может быть синтезирован химическим путем в коммерческих лабораториях или может быть создан путем клонирования, выделения и денатурирования фрагмента ДНК из живого организма. В любом случае ДНК-зонд должен быть помечен молекулярной меткой или маяком, например радиоактивным атомом фосфора (как используется для авторадиографии ) или флуоресцентным красителем (как используется при флуоресцентной гибридизации in situ или FISH ), так что можно увидеть зонд и ДНК, с которой он связывается (рис. 1). Зондируемый образец ДНК также должен быть денатурирован, чтобы сделать его одноцепочечным, чтобы одноцепочечный ДНК-зонд мог отжигаться с одноцепочечным ДНК-образцом в местах, где их последовательности комплементарны.Хотя эти методы ценны для диагностики, их прямое использование для анализа мокроты и других образцов тела может быть проблематичным из-за сложной природы этих образцов. Часто ДНК необходимо сначала выделить из образцов тела с помощью методов химической экстракции, прежде чем ДНК-зонд можно будет использовать для идентификации патогенов.

    Рис. 1. ДНК-зонды могут использоваться для подтверждения наличия подозреваемого патогена в образцах пациентов. На этой диаграмме показано, как можно использовать зонд ДНК для поиска интересующего гена, связанного с предполагаемым патогеном.

    Клиническая направленность: Карни, часть 2

    Этот пример продолжает историю Карни, начавшуюся с книги «Микробы и инструменты генной инженерии».

    Легкие симптомы гриппа, которые испытывает Карни, могут быть вызваны любым количеством инфекционных агентов. Кроме того, некоторые неинфекционные аутоиммунные состояния, такие как рассеянный склероз, системная красная волчанка (СКВ) и боковой амиотрофический склероз (БАС), также имеют симптомы, соответствующие ранним симптомам Карни.Однако в течение нескольких недель симптомы Карни ухудшились. Она начала испытывать боли в суставах в коленях, учащенное сердцебиение и странную вялость лицевых мышц. Кроме того, у нее затекла шея и мучили головные боли. Неохотно она решила, что пора обратиться за медицинской помощью.

    • Дают ли новые симптомы Карни какие-либо ключи к разгадке того, какой у нее тип инфекции или другое заболевание?
    • Какие тесты или инструменты может использовать поставщик медицинских услуг для определения патогена, вызывающего симптомы Карни?

    Мы вернемся к примеру Карни позже на этой странице.

    Электрофорез в агарозном геле

    Существует ряд ситуаций, в которых исследователь может захотеть физически разделить коллекцию фрагментов ДНК разного размера. Исследователь также может переваривать образец ДНК рестрикционным ферментом с образованием фрагментов. Результирующий размер и образец распределения фрагментов часто могут дать полезную информацию о последовательности оснований ДНК, которую можно использовать, подобно сканированию штрих-кода, для идентификации человека или вида, к которым принадлежит ДНК.

    Гель-электрофорез — это метод, обычно используемый для разделения биологических молекул на основе размера и биохимических характеристик, таких как заряд и полярность. Электрофорез в агарозном геле широко используется для разделения ДНК (или РНК) различного размера, которая может быть получена при расщеплении рестрикционными ферментами или другими способами, такими как ПЦР (рис. 2).

    Из-за своего отрицательно заряженного скелета ДНК сильно притягивается к положительному электроду. При электрофорезе в агарозном геле гель ориентируют горизонтально в буферном растворе.Образцы загружают в лунки для образцов на стороне геля, ближайшей к отрицательному электроду, затем протягивают через молекулярное сито агарозной матрицы к положительному электроду. Матрица агарозы препятствует движению более крупных молекул через гель, в то время как молекулы меньшего размера проходят сквозь гель легче. Таким образом, расстояние миграции обратно пропорционально размеру фрагмента ДНК, при этом более мелкие фрагменты проходят большее расстояние через гель. Размеры фрагментов ДНК в образце можно оценить путем сравнения с фрагментами известного размера в ДНК-лестнице , также работающей на том же геле.Чтобы отделить очень большие фрагменты ДНК, такие как хромосомы или вирусные геномы, электрофорез в агарозном геле можно модифицировать, периодически меняя ориентацию электрического поля во время гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE) . В PFGE более мелкие фрагменты могут переориентироваться и мигрировать немного быстрее, чем более крупные фрагменты, и этот метод, таким образом, может служить для разделения очень больших фрагментов, которые в противном случае перемещались бы вместе во время стандартного электрофореза в агарозном геле.В любом из этих методов электрофореза положения фрагментов ДНК или РНК в геле можно определить различными методами. Один из распространенных методов — это добавление бромида этидия , красителя, который внедряется в нуклеиновые кислоты в неспецифических местах и ​​может быть визуализирован при воздействии ультрафиолетового света. Теперь доступны другие пятна, которые безопаснее, чем бромистый этидий, потенциальный канцероген.

    Рисунок 2. Щелкните, чтобы увеличить изображение. (а) Процесс электрофореза в агарозном геле.(б) Исследователь загружает образцы в гель. (c) На этой фотографии показан завершенный цикл электрофореза на агарозном геле. Лестница ДНК расположена на дорожках 1 и 9. Семь образцов расположены на дорожках 2-8. Гель окрашивали бромидом этидия и фотографировали в ультрафиолетовом свете. (Фото a: модификация работы Магнуса Манске; кредит b: модификация работы Министерства сельского хозяйства США; кредит c: модификация работы Джеймса Джейкоба)

    Анализ полиморфизма длины рестрикционного фрагмента (RFLP)

    Сайты узнавания рестрикционного фермента короткие (всего несколько нуклеотидов), палиндромы, специфичные для последовательности, и могут быть обнаружены по всему геному.Таким образом, различия в последовательностях ДНК в геномах индивидуумов приведут к различиям в распределении сайтов узнавания рестрикционных ферментов, которые могут быть визуализированы в виде отдельных полосатых полос на геле после электрофореза в агарозном геле. Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP) Анализ сравнивает образцы полос ДНК различных образцов ДНК после рестрикционного расщепления (рис. 3).

    Рис. 3. ПДРФ-анализ можно использовать для дифференциации последовательностей ДНК. В этом примере нормальная хромосома расщепляется на два фрагмента, тогда как переваривание мутированной хромосомы дает только один фрагмент.Маленькие красные стрелки, указывающие на два разных сегмента хромосомы, показывают расположение сайтов узнавания рестрикционного фермента. После переваривания и электрофореза в агарозном геле диаграммы полос отражают изменение, показывая потерю двух более коротких полос и усиление более длинной полосы. (кредит: модификация работы Национального центра биотехнологической информации)

    Анализ RFLP имеет множество практических применений как в медицине, так и в судебной медицине .Например, эпидемиологи используют анализ ПДРФ для отслеживания и определения источника конкретных микроорганизмов, причастных к вспышкам пищевых отравлений или определенных инфекционных заболеваний. ПДРФ-анализ также может использоваться на ДНК человека для определения паттернов наследования хромосом с вариантными генами, включая те, которые связаны с наследственными заболеваниями, или для установления отцовства .

    Судмедэксперты используют RFLP-анализ как форму отпечатка ДНК , который полезен для анализа ДНК, полученной с мест преступления, подозреваемых и потерпевших.Образцы ДНК собирают, количество копий образцов молекул ДНК увеличивают с помощью PCR , а затем подвергают расщеплению рестрикционными ферментами и электрофорезу в агарозном геле для создания специфических полос. Сравнивая образцы, собранные с места преступления, с образцами, взятыми у подозреваемых или потерпевших, следователи могут окончательно определить, были ли доказательства ДНК, собранные на месте, оставлены подозреваемыми или потерпевшими.

    Саузерн-блоты и модификации

    Несколько молекулярных методов основаны на комплементарности последовательностей и гибридизации между нуклеиновыми кислотами образца и ДНК-зондами.Обычно зондирование образцов нуклеиновых кислот в геле оказывается безуспешным, потому что по мере того, как ДНК-зонд впитывается в гель, нуклеиновые кислоты образца в геле диффундируют. Таким образом, методы блоттинга обычно используются для переноса нуклеиновых кислот на тонкую положительно заряженную мембрану из нитроцеллюлозы или нейлона. В методе Саузерн-блот , разработанном сэром Эдвином Саузерн в 1975 году, фрагменты ДНК в образце сначала разделяются электрофорезом в агарозном геле, а затем переносятся на мембрану за счет капиллярного действия (рис. 4).Фрагменты ДНК, которые связываются с поверхностью мембраны, затем подвергаются воздействию специфического одноцепочечного ДНК-зонда, меченного радиоактивным или флуоресцентным молекулярным маяком , чтобы помочь в обнаружении. Саузерн-блоттинг можно использовать для обнаружения присутствия определенных последовательностей ДНК в данном образце ДНК. После визуализации целевой ДНК внутри мембраны исследователи могут вырезать часть мембраны, содержащую фрагмент, чтобы извлечь интересующий фрагмент ДНК.

    Рисунок 4.В методе саузерн-блоттинга фрагменты ДНК сначала разделяются электрофорезом в агарозном геле, затем переносятся капиллярным действием на нейлоновую мембрану, которую затем пропитывают ДНК-зондом, помеченным молекулярным маяком для облегчения визуализации.

    Варианты саузерн-блоттинга — дот-блот, слот-блот и точечный блот — не включают электрофорез, а вместо этого концентрируют ДНК из образца в небольшом месте на мембране. После гибридизации с ДНК-зондом измеряется интенсивность детектируемого сигнала, что позволяет исследователю оценить количество целевой ДНК, присутствующей в образце.

    Колониальный блот — это еще один вариант саузерн-блоттинга, в котором колонии, представляющие разные клоны в геномной библиотеке, переносятся на мембрану путем прижатия мембраны к культуральной пластине. Клетки на мембране лизируются, и затем мембрану можно исследовать, чтобы определить, какие колонии в геномной библиотеке несут целевой ген. Поскольку колонии на планшете все еще растут, интересующие клетки можно выделить из планшета.

    В нозерн-блоте , другом варианте Саузерн-блоттинга, РНК (не ДНК) иммобилизуют на мембране и исследуют.Нозерн-блоттинг обычно используется для определения количества мРНК, образующейся в результате экспрессии генов в образце ткани или организма.

    Анализ микрочипов

    Другой метод, основанный на гибридизации между комплементарными последовательностями нуклеиновых кислот, называется анализом микрочипов . Микроматричный анализ полезен для сравнения паттернов экспрессии генов между различными типами клеток — например, инфицированными вирусом клетками и неинфицированными клетками или злокачественными клетками и здоровыми клетками (рисунок 5).

    Обычно ДНК или кДНК из экспериментального образца откладывают на предметное стекло вместе с известными последовательностями ДНК. Каждый слайд может содержать более 30 000 различных типов фрагментов ДНК. Отдельные фрагменты ДНК (охватывающие всю геномную библиотеку организма) или фрагментов кДНК (соответствующие полному набору экспрессируемых генов организма) могут быть индивидуально нанесены на предметное стекло.

    После нанесения на предметное стекло геномная ДНК или мРНК могут быть выделены из двух образцов для сравнения.Если мРНК выделена, она подвергается обратной транскрипции в кДНК с использованием обратной транскриптазы. Затем два образца геномной ДНК или кДНК маркируются разными флуоресцентными красителями (обычно красным и зеленым). Затем меченые образцы геномной ДНК объединяют в равных количествах, добавляют в чип микроматрицы и дают возможность гибридизоваться с дополнительными пятнами на микроматрице.

    Гибридизацию образцов молекул геномной ДНК можно отслеживать, измеряя интенсивность флуоресценции в определенных точках микроматрицы.Легко заметить различия в количестве гибридизации между образцами. Если нуклеиновые кислоты только одного образца гибридизуются с определенным пятном на микроматрице, то это пятно будет зеленым или красным. Однако, если нуклеиновые кислоты обоих образцов гибридизуются, пятно станет желтым из-за комбинации красного и зеленого красителей.

    Хотя технология микрочипов позволяет провести полное сравнение двух образцов за короткое время, для этого требуется сложное (и дорогое) оборудование для обнаружения и программное обеспечение для анализа.Из-за дороговизны эта технология обычно ограничивается исследовательскими установками. Исследователи использовали микроматричный анализ, чтобы изучить, как на экспрессию генов влияют организмы, инфицированные бактериями или вирусами или подвергнутые определенным химическим обработкам.

    Рис. 5. (a) Проиллюстрированы этапы анализа микрочипов. Здесь сравниваются паттерны экспрессии генов раковых и здоровых клеток. (b) Информация о микромассиве может быть выражена в виде тепловой карты. Гены показаны слева; различные образцы показаны внизу.Гены, экспрессируемые только в раковых клетках, показаны разными оттенками красного; гены, экспрессируемые только в нормальных клетках, показаны разными оттенками зеленого. Гены, которые экспрессируются как в раковых, так и в нормальных клетках, показаны желтым цветом.

    Изучите технологию микрочипов на этом интерактивном веб-сайте.

    Подумай об этом

    • Из чего состоит ДНК-зонд?
    • Почему после гель-электрофореза дайджеста ДНК используется Саузерн-блоттинг?

    Молекулярный анализ белков

    Во многих случаях может быть нежелательно или невозможно напрямую изучать ДНК или РНК.Белки могут предоставить видоспецифичную информацию для идентификации, а также важную информацию о том, как и реагирует ли клетка или ткань на присутствие патогенного микроорганизма. Различные белки требуют разных методов выделения и характеристики.

    Электрофорез в полиакриламидном геле

    Вариант гель-электрофореза, называемый электрофорезом в полиакриламидном геле (PAGE) , обычно используется для разделения белков. На PAGE гелевая матрица более тонкая и состоит из полиакриламида вместо агарозы.Кроме того, PAGE обычно выполняется с использованием вертикального гелевого аппарата (рис. 6). Из-за различных зарядов, связанных с боковыми цепями аминокислот, PAGE можно использовать для разделения интактных белков на основе их чистых зарядов. В качестве альтернативы белки можно денатурировать и покрыть отрицательно заряженным детергентом под названием додецилсульфат натрия (SDS) , маскируя нативные заряды и позволяя разделение только по размеру. PAGE можно дополнительно модифицировать для разделения белков на основе двух характеристик, таких как их заряды при различных значениях pH, а также их размер, с помощью двумерного PAGE .В любом из этих случаев после электрофореза белки визуализируются путем окрашивания, обычно окрашивания кумасси синим или серебристым.

    Рисунок 6. Щелкните, чтобы увеличить изображение. (а) SDS — это детергент, который денатурирует белки и маскирует их естественные заряды, делая их равномерно отрицательно заряженными. (b) На этих этапах проиллюстрирован процесс SDS-PAGE. (c) Фотография геля SDS-PAGE показывает полосы, окрашенные Кумасси, где белки разного размера мигрировали вдоль геля в ответ на приложенное напряжение.На правой стороне геля видна полоса стандартного размера. (кредит b: модификация работы «GeneEd» / YouTube)

    Подумай об этом

    • На каком основании белки разделяются в SDS-PAGE?

    Клиническая направленность: Карни, часть 3

    Этот пример продолжает историю Карни, начатую в «Микробах и инструментах генной инженерии» и выше.

    Рис. 7. Сыпь типа «бычий глаз» — один из распространенных симптомов болезни Лайма, но до 30% инфицированных людей никогда не заболевают.(кредит: Центры по контролю и профилактике заболеваний)

    Когда Карни описала свои симптомы, ее врач сначала заподозрил бактериальный менингит , который соответствовал ее головным болям и ригидности шеи. Однако вскоре она исключила это как возможность, потому что менингит обычно прогрессирует быстрее, чем то, что было у Карни. Многие из ее симптомов все еще совпадали с симптомами бокового амиотрофического склероза (БАС) и системной красной волчанки (СКВ) , и врач также считал болезнь Лайма возможностью, учитывая, сколько времени Карни проводит в лесу.Карни не помнила, чтобы в последнее время укусили клещи (типичный способ передачи болезни Лайма), и у нее не было типичной бычьей сыпи, связанной с болезнью Лайма (рис. 7). Однако у 20–30% пациентов с болезнью Лайма эта сыпь никогда не появляется, поэтому врач не хотел ее исключать.

    Врач Карни назначил МРТ ее мозга, общий анализ крови на анемию, анализы крови для оценки функции печени и почек, а также дополнительные тесты для подтверждения или исключения СКВ или болезни Лайма.Результаты ее теста не соответствовали ни СКВ, ни БАС, а результат теста на антитела к болезни Лайма был «двусмысленным», то есть неубедительным. Исключив БАС и СКВ, врач Карни решил провести дополнительные тесты на болезнь Лайма.

    • Почему врач Карни все еще подозревал болезнь Лайма, даже если результаты анализов не обнаружили в крови антител Лайма?
    • Какой тип молекулярного теста можно использовать для обнаружения в крови антител к болезни Лайма?

    Мы вернемся к примеру Карни на следующих страницах.

    Методы анализа ДНК на основе амплификации

    Для получения последовательностей ДНК, полезных для изучения болезнетворных организмов, можно использовать различные методы. С появлением технологии быстрого секвенирования наша база знаний обо всех геномах патогенных организмов феноменально выросла. Мы начнем с описания полимеразной цепной реакции, которая не является методом секвенирования, но позволила исследователям и клиницистам получить большие количества ДНК, необходимые для секвенирования и других исследований.Полимеразная цепная реакция устраняет зависимость, которую мы когда-то имели от клеток для создания множественных копий ДНК, достигая того же результата за счет относительно простых реакций вне клетки.

    Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

    Большинство методов анализа ДНК, таких как переваривание рестрикционными ферментами и электрофорез в агарозном геле, или секвенирование ДНК, требуют больших количеств определенного фрагмента ДНК. В прошлом большие количества ДНК производились путем выращивания клеток-хозяев из геномной библиотеки.Однако для подготовки библиотек требуется время и усилия, а интересующие образцы ДНК часто поступают в ничтожных количествах. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет быстро увеличить количество копий конкретных последовательностей ДНК для дальнейшего анализа (см. Рисунок 8). Один из самых мощных методов молекулярной биологии, ПЦР, был разработан в 1983 году Кэри Муллис , работая в Cetus Corporation. ПЦР находит особое применение в исследовательских, судебно-медицинских и клинических лабораториях, в том числе:

    • определение последовательности нуклеотидов в определенной области ДНК
    • амплификация целевой области ДНК для клонирования в плазмидный вектор
    • идентификация источника образца ДНК, оставленного на месте преступления
    • анализ образцов для определения отцовства
    • сравнение образцов древней ДНК с современными организмами
    • определение наличия трудно культивируемых или некультивируемых микроорганизмов в организме человека или пробах окружающей среды

    Рисунок 8.Щелкните, чтобы увеличить изображение. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) используется для получения множества копий определенной последовательности ДНК.

    ПЦР — это лабораторный метод in vitro , который использует преимущества естественного процесса репликации ДНК. Ферменты термостойкой ДНК-полимеразы, используемые в ПЦР, получены из гипертермофильных прокариот. ДНК-полимераза Taq , обычно используемая в ПЦР, происходит от бактерии Thermus aquaticus , выделенной из горячего источника в Йеллоустонском национальном парке.Репликация ДНК требует использования праймеров для инициации репликации, чтобы иметь свободные 3′-гидроксильные группы, доступные для добавления нуклеотидов ДНК-полимеразой. Однако, хотя праймеры, состоящие из РНК, обычно используются в клетках, праймеры ДНК используются для ПЦР. Праймеры ДНК предпочтительны из-за их стабильности, а праймеры ДНК с известными последовательностями, нацеленными на конкретную область ДНК, могут быть химически синтезированы коммерчески. Эти ДНК-праймеры функционально подобны ДНК-зондам, используемым для различных методов гибридизации, описанных ранее, и связываются со специфическими мишенями из-за комплементарности между целевой последовательностью ДНК и праймером.

    ПЦР проводится в течение нескольких циклов, каждый из которых состоит из трех этапов: денатурация, , отжиг, и удлинение. Машины, называемые термоциклером s, используются для ПЦР; эти машины могут быть запрограммированы на автоматический цикл изменения температуры, необходимой на каждом этапе (см. рисунок 1 в «Современные приложения микробной генетики»). Сначала двухцепочечную матричную ДНК, содержащую целевую последовательность, денатурируют примерно при 95 ° C. Высокая температура, необходимая для физического (а не ферментативного) разделения нитей ДНК, является причиной, по которой требуется термостойкая ДНК-полимераза.Затем температуру понижают примерно до 50 ° C. Это позволяет праймерам ДНК, комплементарным концам последовательности-мишени, отжигаться (прилипать) к цепям матрицы, при этом один праймер отжигается с каждой цепью. Наконец, температуру повышают до 72 ° C, оптимальной температуры для активности термостойкой ДНК-полимеразы, что позволяет добавлять нуклеотиды к праймеру с использованием одноцепочечной мишени в качестве матрицы. Каждый цикл удваивает количество копий двухцепочечной ДНК-мишени.Обычно протоколы ПЦР включают 25–40 циклов, что позволяет амплифицировать одну целевую последовательность от десятков миллионов до более чем триллиона.

    Репликация природной ДНК предназначена для копирования всего генома и инициируется в одном или нескольких исходных сайтах. Праймеры конструируются во время репликации, а не до нее, и не состоят из нескольких конкретных последовательностей. ПЦР нацелена на определенные области образца ДНК с использованием праймеров, специфичных для последовательности. В последние годы были разработаны различные методы амплификации изотермической ПЦР , которые позволяют обойти необходимость термоциклирования, используя преимущества дополнительных белков, которые помогают в процессе репликации ДНК.Поскольку разработка этих методов продолжается и их использование становится все более распространенным в исследовательских, судебно-медицинских и клинических лабораториях, термоциклеры могут устареть.

    Углубите свое понимание полимеразной цепной реакции, просмотрев эту анимацию и выполнив интерактивное упражнение.

    Варианты ПЦР

    Несколько более поздних модификаций ПЦР еще больше увеличивают применимость этого метода. ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) используется для получения копий ДНК конкретной молекулы мРНК.ОТ-ПЦР начинается с использования фермента обратной транскриптазы для преобразования молекул мРНК в кДНК . Эта кДНК затем используется в качестве матрицы для традиционной ПЦР-амплификации. ОТ-ПЦР может определить, был ли экспрессирован конкретный ген в образце. Еще одно недавнее применение ПЦР — ПЦР в реальном времени , также известное как количественная ПЦР (кПЦР) . Стандартные протоколы ПЦР и ОТ-ПЦР не являются количественными, потому что любой из реагентов может стать ограничивающим до того, как все циклы в рамках протокола будут завершены, а образцы анализируются только в конце.Поскольку невозможно определить, когда в протоколе ПЦР или ОТ-ПЦР конкретный реагент стал ограничивающим, невозможно узнать, сколько циклов было выполнено до этого момента, и, следовательно, невозможно определить, сколько исходных молекулы матрицы присутствовали в образце в начале ПЦР. Однако в кПЦР использование флуоресценции позволяет отслеживать увеличение двунитевой матрицы во время реакции ПЦР по мере того, как это происходит. Эти кинетические данные затем можно использовать для количественной оценки количества исходной целевой последовательности.Использование КПЦР в последние годы еще больше расширило возможности ПЦР, позволяя исследователям определять количество копий ДНК, а иногда и организмов, присутствующих в образце. В клинических условиях кОТ-ПЦР используется для определения вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных пациентов с целью оценки эффективности их терапии.

    Секвенирование ДНК

    Базовым методом секвенирования является метод терминации цепи , также известный как метод дидезокси или метод секвенирования ДНК Сэнгера , разработанный Фредериком Сангер в 1972 году.Метод терминации цепи включает репликацию ДНК одноцепочечной матрицы с использованием ДНК-праймера для инициации синтеза комплементарной цепи, ДНК-полимеразы, смеси четырех мономеров регулярных дезоксинуклеотидов (dNTP) и небольшой части дидезоксинуклеотидов (ddNTP), каждый из которых мечен молекулярным маяком . ДдНТФ представляют собой мономеры, у которых отсутствует гидроксильная группа (–ОН) в месте, к которому обычно присоединяется другой нуклеотид, образуя цепь (рис. 9).Каждый раз, когда ddNTP случайным образом включается в растущую комплементарную цепь, он прекращает процесс репликации ДНК для этой конкретной цепи. Это приводит к появлению нескольких коротких цепей реплицированной ДНК, каждая из которых оканчивается в разных точках во время репликации. Когда реакционную смесь подвергают гель-электрофорезу, несколько вновь реплицированных цепей ДНК образуют лестницу разных размеров. Поскольку ddNTP мечены, каждая полоса на геле отражает размер цепи ДНК, когда ddNTP завершает реакцию.

    Рис. 9. Дидезоксинуклеотид похож по структуре на дезоксинуклеотид, но в нем отсутствует 3′-гидроксильная группа (обозначена заштрихованной рамкой). Когда дидезоксинуклеотид включается в цепь ДНК, синтез ДНК останавливается.

    Во времена Сэнгера для каждой секвенируемой молекулы ДНК проводили четыре реакции, каждая из которых содержала только один из четырех возможных ddNTP. Каждый ddNTP был мечен радиоактивной молекулой фосфора. Затем продукты четырех реакций прогоняли на отдельных дорожках бок о бок на длинных узких гелях для ПААГ, и полосы разной длины детектировали авторадиографией.Сегодня этот процесс был упрощен с использованием ддНТФ, каждый из которых мечен флуоресцентным красителем или флуорохромом разного цвета (рис.10), в одной реакции секвенирования, содержащей все четыре возможных ддНТФ для каждой секвенируемой молекулы ДНК (рис.11). Эти флуорохромы обнаруживаются с помощью флуоресцентной спектроскопии. Определение цвета флуоресценции каждой полосы при ее прохождении детектором дает нуклеотидную последовательность матричной цепи.

    Рис. 10. Метод терминации дидезокси-цепи Фредерика Сэнгера проиллюстрирован с использованием ddNTP, меченных флуорохромами.Используя ддНТФ, можно получить смесь фрагментов ДНК любого возможного размера, длина которых варьируется только на один нуклеотид. ДНК разделяется по размеру, и каждая полоса может быть обнаружена детектором флуоресценции.

    Рисунок 11. Щелкните, чтобы увеличить изображение. Эта диаграмма обобщает метод секвенирования по Сэнгеру с использованием меченных флуорохромом ддНТФ и капиллярного гель-электрофореза.

    С 2005 года автоматизированные методы секвенирования, используемые лабораториями, подпадают под действие секвенирования нового поколения , которое представляет собой группу автоматизированных методов, используемых для быстрого секвенирования ДНК.Эти методы произвели революцию в области молекулярной генетики, поскольку недорогие секвенаторы могут генерировать последовательности из сотен тысяч или миллионов коротких фрагментов (от 25 до 600 пар оснований) всего за один день. Хотя несколько вариантов технологий секвенирования следующего поколения созданы разными компаниями (например, пиросеквенирование 454 Life Sciences и технология Solexa компании Illumina), все они позволяют быстро секвенировать миллионы оснований, что делает секвенирование целых геномов относительно простым и недорогим, и банально.Например, при секвенировании 454 (пиросеквенирование) образец ДНК фрагментируется на одноцепочечные фрагменты размером 400–600 пар оснований, модифицированные путем добавления адаптеров ДНК к обоим концам каждого фрагмента. Затем каждый фрагмент ДНК иммобилизуют на шарике и амплифицируют с помощью ПЦР с использованием праймеров, предназначенных для отжига с адаптерами, создавая шарик, содержащий множество копий этого фрагмента ДНК. Затем каждую гранулу помещают в отдельную лунку, содержащую ферменты секвенирования. В лунку каждый из четырех нуклеотидов добавляют один за другим; когда каждый из них включен, пирофосфат выделяется как побочный продукт полимеризации, испуская небольшую вспышку света, которая регистрируется детектором.Это обеспечивает порядок включения нуклеотидов при создании новой цепи ДНК и является примером секвенирования синтеза. Секвенсоры нового поколения используют сложное программное обеспечение для выполнения громоздкого процесса упорядочивания всех фрагментов. В целом, эти технологии продолжают быстро развиваться, снижая стоимость секвенирования и быстро увеличивая доступность данных о последовательностях широкого спектра организмов.

    В Национальном центре биотехнологической информации находится широко используемая база данных генетических последовательностей под названием GenBank , куда исследователи хранят генетическую информацию для всеобщего использования.После публикации данных о последовательностях исследователи загружают их в GenBank, предоставляя другим исследователям доступ к информации. Сотрудничество позволяет исследователям сравнивать информацию о вновь обнаруженных или неизвестных последовательностях образцов с огромным массивом данных о последовательностях, которые уже существуют.

    Просмотрите анимацию о секвенировании 454, чтобы лучше понять этот метод.

    Использование NAAT для диагностики

    инфекции C. difficile

    Хавьер, 80-летний пациент с сердечным заболеванием в анамнезе, недавно вернулся домой из больницы после процедуры ангиопластики для вставки стента в сердечную артерию.Чтобы свести к минимуму возможность заражения, Хавьеру внутривенно вводили антибиотики широкого спектра действия во время и вскоре после процедуры. Его выписали через четыре дня после процедуры, но через неделю у него начались легкие спазмы в животе и водянистая диарея несколько раз в день. Он потерял аппетит, сильно обезвоживался, и у него поднялась температура. Он также заметил кровь в стуле. Жена Хавьера позвонила врачу, который посоветовал ей немедленно отвезти его в отделение неотложной помощи.

    Персонал больницы провел несколько тестов и обнаружил, что уровень креатинина в почках Хавьера был повышен по сравнению с уровнями в его крови, что указывает на то, что его почки не функционируют должным образом. Симптомы Хавьера указывают на возможное заражение Clostridium difficile , бактерией, устойчивой ко многим антибиотикам. В больнице собрали и посеяли пробы стула для выявления продукции токсинов A и B C.difficile , но результаты оказались отрицательными. Однако отрицательных результатов было недостаточно, чтобы исключить инфекцию C. difficile , потому что культивирование C. difficile и обнаружение его характерных токсинов может быть затруднено, особенно в некоторых типах образцов. На всякий случай они приступили к диагностическому тесту амплификации нуклеиновой кислоты (NAAT). В настоящее время NAAT являются золотым стандартом клинической диагностики для обнаружения генетического материала патогена.В случае Хавьера, qPCR использовали для поиска гена, кодирующего C. difficile токсина B ( tcdB ). Когда анализ КПЦР оказался положительным, лечащий врач пришел к выводу, что Хавьер действительно страдал от инфекции C. difficile , и немедленно прописал внутривенно антибиотик ванкомицин . Антибиотик избавил от инфекции, и Хавьер полностью выздоровел.

    Рисунок 12. Гель, показывающий продукты ПЦР различных штаммов Clostridium difficile .Образец Хавьера показан внизу; обратите внимание, что он соответствует риботипу 27 в эталонном наборе. (кредит: модификация работы Американского общества микробиологов)

    Поскольку инфекции, вызванные C. difficile , становились широко распространенными в сообществе Хавьера, его образец был дополнительно проанализирован, чтобы выяснить, можно ли идентифицировать конкретный штамм C. difficile . Образец стула Хавьера подвергали риботипированию, и анализу ПЦР на основе повторяющихся последовательностей (повторная ПЦР).При риботипировании короткая последовательность ДНК между генами 16S рРНК и 23S рРНК амплифицируется и подвергается рестрикционному расщеплению (фиг. 12). Эта последовательность варьируется между штаммами C. difficile , поэтому рестрикционные ферменты будут разрезаться в разных местах. В rep-PCR для ПЦР использовали праймеры ДНК, предназначенные для связывания с короткими последовательностями, обычно повторяющимися в геноме C. difficile . После рестрикционного переваривания в агарозном геле был проведен электрофорез в обоих типах анализа для изучения полосатости, полученной в результате каждой процедуры (фиг. 13).Rep-PCR может использоваться для дальнейшего подтипа различных риботипов, увеличивая разрешение для обнаружения различий между штаммами. Было обнаружено, что риботипом штамма, заражающего Хавьера, является риботип 27, штамм, известный своей повышенной вирулентностью, устойчивостью к антибиотикам и повышенной распространенностью в США, Канаде, Японии и Европе.

    Рис. 13. Штаммы инфекционных бактерий, таких как C. difficile, , можно идентифицировать с помощью молекулярного анализа. ПЦР-риботипирование обычно используется для идентификации конкретных C.difficile . Rep-PCR — это альтернативный молекулярный метод, который также используется для идентификации конкретных штаммов C. difficile . (кредит b: модификация работы Американского общества микробиологии)

    • Чем отличаются образцы полосатости между штаммами C. difficile ?
    • Как вы думаете, почему лабораторные тесты не смогли напрямую определить выработку токсинов?

    Подумай об этом

    • Чем ПЦР похож на естественный процесс репликации ДНК в клетках? Чем он отличается?
    • Сравните RT-PCR и qPCR с точки зрения их соответствующих целей.
    • Как определяется идентичность каждого нуклеотида в последовательности при секвенировании с окончанием цепи?

    Ключевые концепции и краткое изложение

    • Для поиска интересующего гена в образце необходимо использовать одноцепочечный ДНК-зонд , помеченный молекулярным маяком (обычно радиоактивным или флуоресцентным), который может гибридизоваться с комплементарной одноцепочечной нуклеиновой кислотой в образце.
    • Электрофорез в агарозном геле позволяет разделять молекулы ДНК по размеру.
    • Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP) Анализ позволяет визуализировать с помощью электрофореза в агарозном геле различные варианты последовательности ДНК, вызванные различиями в сайтах рестрикции.
    • Анализ Саузерн-блоттингом позволяет исследователям находить определенную последовательность ДНК в образце, тогда как анализ Нозерн-блоттинг позволяет исследователям обнаруживать конкретную последовательность мРНК, экспрессируемую в образце.
    • Технология микрочипов — это метод гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет одновременно исследовать многие тысячи генов, чтобы найти различия в генах или паттернах экспрессии генов между двумя образцами геномной ДНК или кДНК,
    • Электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) позволяет разделить белки по размеру, особенно если заряды нативных белков замаскированы путем предварительной обработки SDS.
    • Полимеразная цепная реакция позволяет быстро амплифицировать определенную последовательность ДНК. Варианты ПЦР можно использовать для обнаружения экспрессии мРНК (ПЦР с обратной транскриптазой ) или для количественной оценки конкретной последовательности в исходном образце (ПЦР в реальном времени ).
    • Хотя разработка секвенирования ДНК по Сэнгеру была революционной, достижения в области секвенирования следующего поколения позволяют быстро и недорого секвенировать геномы многих организмов, увеличивая объем новых данных о последовательностях.

    Множественный выбор

    Какой метод используется для разделения фрагментов белка по размеру?

    1. Электрофорез в полиакриламидном геле
    2. Саузерн-блот
    3. Электрофорез в агарозном геле
    4. полимеразная цепная реакция
    Показать ответ

    Ответ а. Электрофорез в полиакриламидном геле используется для разделения фрагментов белка по размеру.

    В каком методе используется расщепление рестрикционными ферментами с последующим электрофорезом в агарозном геле для создания полосатости для сравнения с другим образцом, обработанным таким же образом?

    1. кПЦР
    2. ОТ-ПЦР
    3. RFLP
    4. 454 секвенирования
    Показать ответ

    Ответ c.ПДРФ использует переваривание рестрикционными ферментами с последующим электрофорезом в агарозном геле для создания полосатости для сравнения с другим образцом, обработанным таким же образом.

    Все следующие методы включают гибридизацию между одноцепочечными молекулами нуклеиновой кислоты , кроме :

    1. Саузерн-блот-анализ
    2. Анализ RFLP
    3. Нозерн-блот анализ
    4. микроматричный анализ
    Показать ответ

    Ответ б. ПДРФ-анализ не включает гибридизацию между одноцепочечными молекулами нуклеиновой кислоты.

    Заполните пробел

    Метод __________ блоттинга используется для поиска фрагмента РНК в образце, который комплементарен зонду ДНК.

    Показать ответ

    Техника блоттинга Northern используется для поиска фрагмента РНК в образце, который комплементарен зонду ДНК.

    Стадия ПЦР, во время которой двухцепочечная матричная молекула становится одноцепочечной, называется _____________.

    Показать ответ

    Стадия ПЦР, во время которой двухцепочечная матричная молекула становится одноцепочечной, называется денатурацией .

    Метод секвенирования, включающий включение ddNTP, называется __________.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *