Определение белки: Как определить белок

Содержание

Как определить белок

АльбуминыАльбуминыДействие на белок солей тяжёлых металловКсантопротеиновая реакцияБиуретовая реакцияБиуретовая реакция

Существуют несколько несложных способов, как определить белок. Для этого воспользуемся некоторыми его характерными свойствами.

Одна из групп, на которые разделяются все существующие белки – это белки альбумины. Эта группа наиболее распространена и наиболее известна. К альбуминам относится белок из куриных яиц, содержится в крови человека и животных, а также в растениях, мышцах и молоке.

Чтобы определить эту группу белка, воспользуемся её свойствами растворимости в воде. Если альбумины нагревать – они изменяют свою структуру, то есть «сворачиваются».

Итак, попробуем определить белок. Используем, например, сыворотку коровьей крови или яичный сырой белок. Поместим его в кастрюльку, можно разбавить водой и буден нагревать на медленном огне до кипения.

Растворим немного соли в белковом растворе и прильём немного Оцет (уксусную кислоту).

В результате реакции увидим, что из раствора будут выпадать белые хлопья.

Определить белок можно и другим простым способом: белок изменяют структуру под воздействием спирта, поэтому достаточно к белковому раствору прилить такой же объём спирта. Так же, как и в предыдущем случае, мы увидим выпадение белка в виде белых хлопьев.

А вот следующий интересный опыт можно назвать ещё и полезным. Определить белок можно, используя соли тяжёлых металлов. Например, соль меди, железа, свинца (медный купорос CuSO4, хлориды железа FeCl

2, FeCl3, нитрат свинца Pb(NO3)4 и др.). Если к водному раствору белка добавить одну (или несколько) таких солей, то выпадает осадок химического соединения белка с тяжёлым металлом. Для нашего организма, да и для организма животных соли тяжёлых металлов – ядовитые вещества, способствующие разрушению белка!

Определить белок также можно с помощью действия не него минеральных кислот (кроме ортофосфорной H3PO4). Если в пробирку налить азотную кислоту, а затем, осторожно, по стенке пробирки капнуть раствор белка, то по окружности стенки пробирки образуется белое кольцо выпавшего белка.

Ещё одна группа белков, называемая глобулинами – в отличии альбуминов не — растворяется в воде. Глобулины хорошо растворимы, если в растворе присутствуют соли. Содержатся глобулины в некоторых частях растений, молоке и мышцах живых организмов. К тому же установлено, что глобулины, выявленные в растениях, растворяются в 70% спирте!

И ещё одна группа белков – склеропротеины, к которым относятся ткани живых организмов, например, ногти, волосы, роговица глаза, а также костные ткани, рога животных и шерсть. Склеропротеины не растворяются в воде и не растворяются в спирте, но при их обработке сильными растворами кислот они приобретают способность растворяться, при этом частично разлагаться.

Глобулины и склеропротеины можно определить с помощью ксантопротеиновой реакции. Это цветная реакция определения белка, при которой, если нагреть пробу, содержащую белок, то проба изменит цвет на жёлтый. Затем при нейтрализации кислоты щёлочью цвет поменяется на оранжевый.
Такую реакцию, возможно, некоторым уже приходилось наблюдать на собственном опыте, когда на кожу попадала азотная кислота.

Следующая

реакция по определению белкабиуретовая, которая заключается в добавлении разбавленного раствора натриевой или калиевой щёлочи к раствору белка. В тот же раствор необходимо добавить несколько капель раствора медного купороса. Наблюдаем изменение цвета раствора на красный, затем фиолетовый и сине-фиолетовый.

Если белок длительно нагревать в растворе кислот, то он будет расщепляться на составляющие – пептиды, затем до составляющих его аминокислот, что применяют в промышленности для приготовления приправ к пище.

Определение содержание органического белка в пищевых продуктах: какой метод выбрать?

При выборе наиболее оптимального метода определения белка в пищевых продуктах особое внимание следует уделить его безопасности для оператора и окружающей среды, времени анализа, вопросу подготовки специалиста, соответствию международным стандартам и пр.

Кроме того, выбор должен базироваться на возможностях лаборатории в подборе оборудования, соответствующего поставленным задачам. Предлагаем Вам посмотреть видео, или прочесть статью.

Также предлагаем почитать подробную информацию о методе Кьельдаля и оборудовании для его реализации на специализированном сайте apk.hlr по ссылке. Детально о методе Дюма Вы можете почитать

тут.

Определение содержание органического белка методом Кьельдаля

Метод был разработан в 1883 году датским химиком Иоганном Кьельдалем в лаборатории Carlsberg. Он позволяет количественно определять содержание органического белка в пробе. Основан на разрушении пептидной связи с последующим высвобождением молекулы азота и его количественного анализа с помощью титрования. 

Классический метод Кьельдаля предусматривает три простых этапа: разложение, дистилляцию и титрование. После титрования использованное количество титранта соответствует концентрации азота, который был в образце. Перерасчет на белок происходит с помощью коэффициента перерасчета F (6,25 = 0,16 г азота на 1 г белка). Полное время анализа одного составляет образца составляет около 2 часов. Метод достаточно чувствительный, предел определения – 0,1 мг азота. 

Нагреватели, колбы, стеклянные холодильники – когда метод только открыли, все исполнялось исключительно в ручном режиме. Сегодня же все три этапа – разложение, дистилляция и титрование – могут быть легко выполнены с помощью автоматических систем для анализа белка по Кьельдалю: 

  • Минерализатора для разложения образца.
  • Дистиллятора для отгонки аммиака.
  • Скруббера для нейтрализации газов.

Преимущества метода Кьельдаля:

  1. Это референтный метод, который соответствует всем международным стандартам. 
  2. Доступность оборудования, возможность поэтапной комплектации. Например, сначала можно приобрести анализатор, а потом дистиллятор.  
  3. Все современные приборы анализа белка по методу ИК-спектрометрии калибруются на основе метода Кьедаля как эталонного. 

Определение содержание органического белка методом Дюма

Создан химиком Жаном Батистом Дюма в 1848 году. Метод обеспечивает определение общего азота в образце благодаря его полному сжиганию в сфере кислорода. Является альтернативой методу Кьельдаля. Но кроме органического определяет еще и неорганический азот.

Как и по Кьельдалю, так и по Дюма используются коэффициенты пересчета азота на белок. После открытия метод Дюма широкого распространения не получил. Возможно из-за того, что физически выполнить его сложнее. Он предполагает очень высокую температуру сгорания – около 1000-1300 ⁰С. 

Сегодня различные производители предлагают анализаторы по этому методу. Как они работают? 

Вы берете образец (достаточно 100 мг, чтобы провести анализ) и заворачиваете его в фольгу. Он сгорает при высокой температуре. Далее образец восстанавливается в следующей камере, где есть соединения меди. Потом азот проходит очищение: побочные продукты сгорания абсорбируются путем прохождения через скрубберы. В результате получаем чистый восстановленный азот, который определяется с помощью детектора теплопроводимости (TCD). 

Преимущества метода Дюма:

  1. Нет необходимости использовать прекурсоры, а значит, оформлять горы документации. 
  2. Отсутствие потери азота на стадии переноса образцов. 
  3. Существенно короче время анализа, включая этап пробоподготовки: Дюма – до 1 часа, Кьельдаля – до 3 часов. 
  4. Исключение ошибки оператора. Забота о его здоровье и состоянии окружающей среды. 

Сравнение методов Дюма и Кьельдаля

Метод Дюма 

Метод Кьельдаля 

Высокая производительность
Относительно низкая производительность
Короткое время анализа
Значительные затраты времени
Отсутствие больших затрат на обслуживание
Доступное по стоимости оборудование
Работает без присмотра
Требует вмешательство оператора
Отсутствие кислот или другой мокрой химии
Использование кислот и щелочей
Отсутствие вредных выбросов
Дорогостоящая утилизация выбросов

Определение содержание органического белка экспресс-методом NIR-спектрометрии

Инфракрасное излучение с помощью светофильтров открыл Уильям Гершель в 1800 году. Прорыв в NIR-спектрометрии был сделан благодаря работе Уильяма Эбнея и Эдварда Фестинга. Они первыми сняли ИК-спектр органической жидкости в диапазоне 1-1,2 µм в 1881 году. 

В основе метода лежит пропускание или отражение в ближнем инфракрасном диапазоне и последующее сравнение полученного спектра с результатами базы данных калибровок. 

Главные преимущества метода ИК-спектрометрии:

  1. Значительное меньшие затраты времени по сравнению с другими методами: полный анализ можно сделать за 10 минут.
  2. За короткое время можно получить большое количество показателей.
  3. Отсутствие расходных материалов или реактивов.
  4. Малые затраты труда.
  5. Высокая точность может быть достигнута постоянным усовершенствованием калибровок.

Этот метод наиболее востребован на производстве цельнозерновых, комбикормов и мукомольной продукции.

Лидер среди предлагаемого на рынке оборудования NIR-спектрометрии – Infratec 1241/Nova от компании FOSS. Наличие в приборе большой базы калибровок, а также специальных модулей и кювет позволяет очень точно определять: влажность, белок, жир, зольность, клейковину, крахмал, бушельный вес, абсорбционную способность муки после помола и многие другие показатели.  

Где еще используется NIR-спектрометрия?

Этап
Продукты/Напитки
Корма для животных
R&D
Разработка продукта
Разработка рецептуры
Хранение
Определение качества сырья, проверка товаров
Определение качества сырья, проверка товаров
Производство
Контроль промежуточных этапов производства
Оптимизация рецептуры
Готовая продукция
Проверка соответствия состава маркировке
Соответствие маркировке

Особенно важно использовать эффективный экспресс-метод для готовой продукции. Это дает возможность за короткий промежуток времени увидеть, насколько завершенным является ваш конечный продукт. 

Явные преимущества перед методами Къельдаля и Дюма

  • Метод ИК-спектрометрии предполагает анализ без разрушения образца.
  • Отсутствует пробоподготовка, а результаты вы получите уже через 20-40 секунд.
  • При анализе содержания белка методом ИК-спектрометрии не нужны расходные материалы.
  • Нет необходимости специально обучать оператора – все операции здесь предельно просты.
  • Прибор вы можете использовать как в лаборатории, так и на производстве.
  • Отсутствие прекурсоров и вреда для окружающей среды избавляет от необходимости оформления большого количества документов.
  • В отличие от двух других описанных методов ИК-спектрометрия не предполагает использования высоких температур.
Обозначения 
Кьельдаля 
Дюма
ИК-спектрометрия
Представление образца 
Разрушение (сжигание)
Разрушение (сжигание)
Без разрушения
Пробоподготовка 
Да
Да
Отсутствует
Время анализа 
2-4 ч
5 мин (подготовка – 1 час)
20-40 с
Необходимость
расходных материалов

Да
Да
Отсутствует
Подготовка специалиста 
Высокая
Высокая
Низкая или отсутствует
Место анализа 
Лаборатория
Лаборатория
Лаборатория или производство
Необходимость прекурсоров 
Да
Нет
Нет
Работа с высокой температурой 
Да (420 ⁰С)
Да (900 ⁰С)
Нет
Вред для окружающей среды 
Высокий
Средний
Отсутствует

Таким образом, владея полной информацией о возможностях и недостатках каждого метода и оценив задачи и объем работы собственной лаборатории, производитель сможет выбрать наиболее подходящий метод количественного определения белка и соответствующее оборудование для его надлежащего выполнения. А значит – доказать качество и установить правильную цену на свою продукцию. 

Анар Рахметов,
эксперт группы пищевых технологий

ООО «ХИМЛАБОРРЕАКТИВ»

Справочная информация: Оборудование для определения белка в пищевых продуктах:

ОФС.1.2.3.0012.15 Определение белка | Фармакопея.рф

Содержимое (Table of Contents)

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Взамен ст. ГФ XII, ч.1, ОФС 42-0053-07

Определение содержания белка проводят в лекарственных средствах, выделенных из природных источников или полученных биотехнологическими методами.

Для таких лекарственных средств могут использоваться модифицированные методики определения белка, указанные в фармакопейных статьях, в которых могут быть изменены рекомендуемые области концентраций белка и/или объемы испытуемого раствора и реактивов и некоторые другие условия в соответствии с индивидуальными свойствами определяемого компонента.

Колориметрические и некоторые спектрофотометрические методы требуют использования стандартного образца. В качестве стандартного образца белка используют: стандартный образец присутствующего в препарате белка, или бычий сывороточный альбумин, или сывороточный альбумин человека, высушенные перед испытанием до постоянной массы (стандартный образец и условия высушивания указывают в фармакопейной статье).

Для количественного определения белка используют спектрофотометрические, колориметрические и спектрофлуориметрические методы.

Метод 1 (Спектрофотометрический)

Метод основан на способности ароматических аминокислот (тирозина, триптофана и, в меньшей степени, фенилаланина), входящих в последовательность молекулы белка, поглощать ультрафиолетовый свет при длине волны около 280 нм.

Для растворения молекул белка используют различные растворители: воду, натрия хлорид раствор 0,9 %, различные буферные растворы и др.

При использовании буферного раствора для растворения молекул белка, имеющего высокое значение оптической плотности по отношению к воде, свидетельствует о присутствии в белковой молекуле интерферирующего  вещества. Для устранения влияния интерферирующего  вещества на результаты анализа следует использовать в качестве раствора сравнения вместо воды буферный раствор. Если интерферирующие вещества имеют высокую оптическую плотность, результаты анализа  могут быть подвергнуты сомнению.

При низких концентрациях белок адсорбируется на стенках кюветы, что может приводить к заниженным результатам содержания белка в растворе. В этом случае испытуемый раствор препарата предварительно концентрируют или используют при приготовлении испытуемого раствора неионные детергенты.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого вещества в буферном растворе, указанном в фармакопейной статье, с концентрацией белка от 0,2 мг/мл до 2,0 мг/мл.

Стандартный раствор. Готовят раствор соответствующего стандартного образца в том же буферном растворе и с той же концентрацией белка, что и в испытуемом растворе.

Методика. Испытуемый раствор, стандартный раствор и раствор сравнения выдерживают при одинаковой температуре. Температуру и время инкубации указывают в фармакопейной статье. Определяют оптические плотности испытуемого и стандартного растворов в кварцевых кюветах при длине волны 280 нм, используя тот же буферный раствор в качестве раствора сравнения.

Для получения достоверных и точных результатов значения оптической плотности растворов должны удовлетворять требованиям линейности в интервале определяемых концентраций белка.

Для высокоочищенных белков концентрацию белка в растворе вычисляют с использованием удельного показателя поглощения.

Рассеяние света. Точность определения содержания белка в ультрафиолетовой области снижается, если белки в растворе существуют в виде частиц, сравнимых по размеру с длиной волны измеряемого света (250 – 300 нм). Рассеяние светового потока приводит к увеличению оптической плотности испытуемого раствора. При расчете оптической плотности испытуемого раствора при длине волны 280 нм, обусловленной рассеянием света, определение проводят при длинах волн 320 нм, 325 нм, 330 нм, 335 нм, 340 нм и 350 нм.

Строят график зависимости десятичного логарифма (lg) оптической плотности от lg соответствующей длины волны. Экстраполируют кривую методом линейной регрессии для определения логарифма оптической плотности при длине волны 280 нм. Антилогарифм этого значения соответствует оптической плотности за счет рассеяния света. Для расчета истинного содержания белка в испытуемом растворе оптическую плотность раствора, полученную при 280 нм, корректируют, вычитая оптическую плотность, относящуюся к рассеянному свету.

Снизить эффект рассеянного света в опалесцирующих растворах можно фильтрованием через фильтр с размером пор 0,2 мкм, не адсорбирующим белок, или центрифугированием. Условия фильтрования и центрифугирования указывают в фармакопейной статье.

Расчеты. Концентрацию белка в испытуемом растворе (С) в мг/мл вычисляют по формуле:

С = С0 ∙ А/А0,

где

С0 — концентрация белка в растворе стандартного образца, в мг/мл;

А и А0 – скорректированные значения оптической плотности испытуемого раствора и раствора стандартного образца соответственно.

Метод 2 (Метод Лоури, колориметрический)

Метод основан на реакции белков с солями меди (II) в щелочном растворе и восстановлении фосфорномолибдено-вольфрамового реактива (реактив Фолина) с образованием окрашенных продуктов, интенсивность окраски которых определяют по оптической плотности при длине волны 750 нм. Реактив Фолина взаимодействует с остатками ароматических аминокислот белка, главным образом тирозина, а также триптофана и фенилаланина и, в меньшей степени, цистеина. Развитие окраски достигает максимума через 20 – 30 мин при комнатной температуре, в дальнейшем идет уменьшение ее интенсивности. Степень окрашивания зависит от природы белка. Поскольку различные виды белков могут давать цветные реакции различной интенсивности, испытуемый белок должен соответствовать стандартному образцу.

Определению мешают некоторые соли, тиоловые соединения, углеводы, липиды, неионные детергенты, органические растворители, комплексоны и некоторые другие соединения. Большинство мешающих веществ дает слабое окрашивание, однако применение некоторых детергентов приводит к значительному увеличению окраски. Высокая концентрация соли может являться причиной образования осадка. Для уменьшения влияния веществ, мешающих определению, проводят дополнительное разведение раствора, обеспечивающее концентрацию испытуемого белка на уровне, достаточном для проведения точных измерений, или осаждение белков растворами натрия дезоксихолата и трихлоруксусной кислоты.

Стандартные растворы. Растворяют соответствующий стандартный образец белка в буферном растворе, указанном в фармакопейной статье. Части полученного раствора разводят в том же буферном растворе для получения не менее чем пяти стандартных растворов, имеющих концентрации белка, равномерно распределенные в интервале между  5 мкг/мл и 100 мкг/мл.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого лекарственного средства в буферном растворе, указанном в фармакопейной статье, с концентрацией белка, находящейся в пределах интервала концентраций калибровочного графика.

Контрольный раствор. Используют буферный раствор, применяемый для приготовления стандартных и испытуемого растворов.

Метод А (без предварительного осаждения белка).

К 1,0 мл каждого из стандартных растворов, испытуемого раствора и к 1,0 мл контрольного раствора, прибавляют по 5,0 мл реактива В. Содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 — 30 мин при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку прибавляют 0,5 мл реактива Фолина, разбавленного перед употреблением водой в 2 раза, быстро и тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов на спектрофотометре при длине волны 750 нм (или указанной в фармакопейной статье), используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения. Окраска остается стабильной в течение 2 часов. Допускается использование коммерческого реактива Фолина-Чокалтеу.

Зависимость оптической плотности от концентрации белка носит нелинейный характер, тем не менее, если интервал концентраций, используемых для построения калибровочного графика, небольшой, то она приближается к линейной. Строят зависимости оптических плотностей стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения калибровочной кривой. На основании калибровочной кривой и оптической плотности испытуемого раствора определяют концентрацию белка в испытуемом растворе.

Калибровочный график строят каждый раз при приготовлении новых реактивов или использовании другого спектрофотометра, но не реже 1 раза в 3 мес.

Примечания:

  1. Приготовление реактива А. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 2 г натрия карбоната, растворяют в 0,1 М растворе натрия гидроксида и доводят объем до метки этим же раствором, перемешивают.

Срок годности раствора 1 мес.

  1. Приготовление реактива Б. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,5 г меди сульфата, 1 г калия-натрия тартрата, растворяют в воде и доводят до метки.

Срок годности раствора: 2 мес.

  1. Приготовление реактива В. Перед анализом смешивают 50,0 мл реактива А и 1,0 мл реактива Б.

Метод Б (с натрия додецилсульфатом).

Определение проводят, как описано в методе А, но вместо 5 мл реактива В к растворам прибавляют по 1 мл щелочного реактива меди и по 0,5 мл разведенного реактива Фолина.

Примечания:  

  1. Приготовление сульфатного реактива меди. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют в воде 0,2 г меди сульфата и 0,4 г натрия тартрата, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют в воде 10 г натрия карбоната, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Медленно приливают раствор натрия карбоната к раствору меди сульфата при перемешивании. Раствор используют в течение 24 часов.
  2. Приготовление щелочного реактива меди. 1 объем полученного раствора сульфатного реактива меди смешивают с 2 объемами 5 % раствора натрия додецилсульфата (50 г/л) и 1 объемом 3,2 % раствора натрия гидроксида
    (32 г/л).

Срок годности раствора: 2 недели при комнатной температуре.

  1. Приготовление разведенного реактива Фолина. Смешивают 5 мл реактива Фолина с 55 мл воды.

Раствор хранят в банках темного стекла при комнатной температуре.

 

Метод В (с предварительным осаждением белка).

Методика. К 1,0 мл испытуемого раствора прибавляют 0,1 мл раствора натрия дезоксихолата. Раствор перемешивают на вихревой мешалке и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин. Прибавляют 0,1 мл 72 % раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают на вихревой мешалке. Осадок отделяют центрифугированием в течение 30 мин при 3000 g. Осторожно удаляют надосадочную жидкость, оставшийся осадок растворяют в 1 мл щелочного реактива меди. Далее поступают, как описано выше в методе Б.

При построении калибровочного графика стандартные растворы белка следует обрабатывать аналогичным способом.

В качестве раствора сравнения используют пробу, содержащую 0,1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, 0,9 мл воды, 5,0 мл реактива В и 0,5 мл разбавленного в 2 раза реактива Фолина.

Примечания:

  1. Приготовление 0,15 % раствора натрия дезоксихолата. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,15 г натрия дезоксихолата и растворяют в воде. Объем раствора доводят до метки водой и тщательно перемешивают.
  2. Приготовление 72 % раствора трихлоруксусной кислоты. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают 360 г трихлоруксусной кислоты и растворяют в воде. Объем раствора доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Срок годности 72 % раствора трихлоруксусной кислоты 1 мес.

Метод 3 (Метод Бредфорд, колориметрический)

Данный метод основан на смещении максимума поглощения оптической плотности красителя кислотного синего 90 (Кумасси бриллиантовый синий R-250) от 470 нм до 595 нм, наблюдаемой вследствие связывания белка с красителем. Краситель наиболее активно связывается с остатками аргинина и лизина белка, что может приводить к погрешности при количественном определении различных видов белков. Белок, используемый в качестве стандартного образца, должен быть таким же, как испытуемый белок.

Существует относительно небольшое влияние интерферирующих веществ, которого можно избежать, не используя детергенты и амфолиты в испытуемом образце. Сильнощелочные образцы могут взаимодействовать с кислотным реактивом.

Стандартные растворы. Растворяют соответствующий стандартный образец белка в буферном растворе, указанном в фармакопейной статье. Части полученного раствора разводят в том же буферном растворе для получения не менее чем пяти стандартных растворов, имеющих концентрации белка, равномерно распределенные в интервале между 0,1 мг/мл и 1 мг/мл.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого лекарственного средства в буферном растворе, указанном в фармакопейной статье, с концентрацией белка, находящейся в пределах интервала концентраций калибровочного графика.

Контрольный раствор. Используют буферный раствор, применяемый для приготовления стандартных и испытуемого растворов.

Методика. Прибавляют 5 мл реактива Бредфорд к 0,1 мл каждого стандартного раствора, испытуемого раствора и контрольного раствора. Тщательно перемешивают, переворачивая. Избегают образование пены, приводящей к плохой воспроизводимости. Выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин и измеряют оптические плотности стандартных растворов и испытуемого раствором на спектрофотометре при длине волны 595 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения, содержащего растворитель и реактив Бредфорд. При определении не следует использовать кварцевые спектрофотометрические кюветы, поскольку краситель связывается с этими материалами. Окраска остается стабильной в течение 1 ч.

Зависимость оптической плотности от концентрации белка носит нелинейный характер, тем не менее, если интервал концентраций, используемых для построения калибровочного графика, небольшой, то она приближается к линейной. Строят зависимости оптических плотностей стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения калибровочной кривой. На основании калибровочной кривой и оптической плотности испытуемого раствора определяют концентрацию белка в испытуемом растворе.

В нормативных документах допускается изменение объемов испытуемого раствора и реактива Бредфорд при соблюдении линейной зависимости оптической плотности от концентрации белка при построении калибровочного графика.

Калибровочный график строят каждый раз при приготовлении новых реактивов или использовании другого спектрофотометра, но не реже 1 раза в 3 мес.

Примечание:

Приготовление реактива Бредфорд. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают 0,05 г кислотного синего 90 (Кумасси бриллиантовый синий R-250), растворяют в 25 мл спирта 96%, прибавляют 50 мл фосфорной кислоты концентрированной, доводят объем раствора водой до метки и тщательно перемешивают. Фильтруют и хранят в банках темного стекла при комнатной температуре. Если при хранении выпадает осадок красителя, перед использованием реактив необходимо профильтровать.

Срок годности 2 недели.

Метод 4 (Метод с бицинхониновой кислотой, колориметрический)

Метод основан на восстановлении ионов меди Cu2+ до ионов меди Cu1+ при взаимодействии с остатками цистеина, цистина, триптофана, тирозина, пептидной связью белка и образовании окрашенного комплекса Cu+ с бицинхониновой кислотой (2,2’-бихинолин-4,4’-дикарбоновая кислота). Определению мешают восстанавливающие вещества: сахара, аскорбиновая кислота, тиоловые соединения, этилендиаминтетраацетат. Влияние мешающих веществ может быть минимизировано путем разведения, обеспечивающего концентрацию белка на уровне, достаточном для проведения точных измерений. В качестве альтернативы можно использовать методику осаждения белка, описанную в определении белка по методу Лоури. Поскольку интенсивность окраски образующегося комплекса зависит от природы белка, белок стандартного образца должен быть тот же, что и в испытуемом образце.

Стандартные растворы. Соответствующий стандартный образец белка растворяют в буферном растворе, указанном в фармакопейной статье. Части полученного раствора разводят в том же буферном растворе для получения не менее чем пяти стандартных растворов, имеющих концентрации белка, равномерно распределенные в интервале между 10 мкг/мл и 1200 мкг/мл.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого лекарственного средства в буферном растворе, указанном в фармакопейной статье, с концентрацией белка, находящейся в пределах интервала концентраций калибровочного графика.

Контрольный раствор. Используют буферный раствор, применяемый для приготовления стандартных и испытуемого растворов.

Методика. Прибавляют к 0,1 мл каждого стандартного раствора, испытуемого раствора и контрольного раствора 2,0 мл реактива медно- бицинхониновой кислоты. Растворы выдерживают при температуре 37 ºС в течение 30 мин, засекают время и охлаждают смесь до комнатной температуры. Через 60 мин после окончания инкубации при 37 ºС измеряют оптические плотности стандартных растворов и испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 562 нм в кварцевых кюветах, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения.

Зависимость оптической плотности от концентрации белка носит нелинейный характер, тем не менее, если интервал концентраций, используемых для построения калибровочного графика, небольшой, то она приближается к линейной. Строят зависимости оптических плотностей стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения калибровочной кривой. На основании калибровочной кривой и оптической плотности испытуемого раствора определяют концентрацию белка в испытуемом растворе.

Примечания:

  1. Приготовление реактива бицинхониновой кислоты. В мерную колбу вместимостью 1 л помещают 10 г динатриевой соли бицинхониновой кислоты, 20 г натрия карбоната моногидрата, 1,6 г натрия тартрата, 4 г натрия гидроксида, 9,5 г натрия гидрокарбоната, растворяют в воде. При необходимости значение рН полученного раствора доводят до 11,25 раствором натрия гидроксида 10 % или натрия гидрокарбоната 5 %. Доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
  2. Приготовление реактива медно- бицинхониновой кислоты. Смешивают 1,0 мл 4 % раствора меди сульфата (40 г/л) и 50,0 мл реактива бицинхониновой кислоты.

Метод 5 (Колориметрический метод с биуретовым реактивом)

Метод основан на взаимодействии ионов двухвалентной меди с пептидными связями молекулы белка в щелочной среде с образованием окрашенного комплекса, оптическая плотность которого измеряется при длине волны 540 нм. Этот метод показывает минимальные различия между равными количествами иммуноглобулиновых и альбуминовых белков.

Метод не рекомендован для проведения реакции в растворах, содержащих соли аммония, а также для мутных или образующих осадок растворов. Для устранения влияния мешающих веществ проводят осаждение белка из раствора испытуемого образца следующим образом: к 1 объему раствора испытуемого образца прибавляют 0,1 объем 50 % раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают на  вихревой мешалке и выдерживают при  комнатной температуре в течение 10 мин, центрифугируют при 3000 g в течение 30 мин. Удаляют надосадочную жидкость и растворяют осадок в небольшом объеме  0,5 М раствора натрия гидроксида. Полученный раствор используют для приготовления испытуемого раствора.

При построении калибровочного графика стандартные растворы белка следует обрабатывать аналогичным способом.

Стандартные растворы. Если иное не указано в фармакопейной статье, растворяют соответствующий стандартный образец белка в 0,9 % растворе натрия хлорида. Части полученного раствора разводят 0,9 % раствором натрия хлорида для получения не менее трех стандартных растворов с концентрациями в интервале от 2 мг/мл до  10 мг/мл.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого лекарственного средства в 0,9 % растворе натрия хлорида с концентрацией белка, находящейся в пределах интервала концентраций стандартных растворов.

Контрольный раствор. Используют 0,9 % раствор натрия хлорида.

Методика. К 1,0 мл испытуемого раствора, каждого из стандартных растворов и контрольного раствора прибавляют 4,0 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов при длине волны 540 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения (или указанной в фармакопейной статье, в пределах 540 — 650 нм).

Зависимость оптической плотности от концентрации белка носит нелинейный характер. Однако в небольшом интервале концентраций, используемых для построения калибровочного графика, она приближается к линейной. Строят график зависимости оптических плотностей стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения калибровочной кривой. На основании калибровочной кривой и оптической плотности испытуемого раствора определяют концентрацию белка в испытуемом растворе.

Калибровочный график строят каждый раз при приготовлении новых реактивов или использовании другого спектрофотометра, но не реже 1 раза в 3 мес.

Примечание:

Приготовление 50 % раствора трихлоруксусной кислоты. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают 250 г трихлоруксусной кислоты и растворяют в воде. Объем раствора доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Срок годности 50 % раствора трихлоруксусной кислоты 1 мес.

Метод 6 (Флуорометрический метод с о-фталальдегидом)

Метод основан на дериватизации белка о-фталальдегидом, который реагирует с первичными аминогруппами белка (N-концевая аминокислота и
ε-аминогруппа остатков лизина) с последующим измерением флуоресценции полученного комплекса. Чувствительность количественного определения может быть увеличена гидролизом белка перед добавлением о-фталальдегида. Гидролиз делает α-аминогруппу, входящую в структуру аминокислот, доступной для взаимодействия с фталальдегидным реактивом. Метод является высокочувствительным и требует небольшого количества белка.

Определению мешают  буферные растворы, содержащие первичные амины, такие как трис(гидроксиметил)аминометан, и аминокислоты, которые взаимодействуют с о-фталальдегидом. Аммиак в больших концентрациях также взаимодействует с о-фталальдегидом. Флуоресценция, полученная при взаимодействии аминов с о-фталальдегидом, может быть нестабильной. Использование автоматизированных методик для стандартизации данного метода позволяет повысить точность и воспроизводимость определения.

Стандартные растворы. Растворяют соответствующий стандартный образец белка в 0,9 % растворе натрия хлорида. Части полученного раствора разводят 0,9 % раствором натрия хлорида для получения не менее пяти стандартных растворов с концентрациями в интервале от 10 мкг/мл до 200 мкг/мл. Доводят значение рН раствора до 8,0 — 10,5 перед добавлением фталальдегидного реактива.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого лекарственного средства в 0,9 % растворе натрия хлорида с концентрацией белка, находящейся в пределах интервала концентраций стандартных растворов. Доводят значение рН раствора до 8,0-10,5 перед добавлением фталальдегидного реактива.

Контрольный раствор. Используют 0,9 % раствор натрия хлорида.

Методика. Смешивают 10 мкл испытуемого раствора, каждого из стандартных растворов и контрольного раствора с 0,1 мл фталальдегидного реактива и выдерживают при комнатной температуре в течении 15 мин. Прибавляют 3 мл 0,5 М раствора натрия гидроксида и перемешивают. Определяют интенсивность флуоресценции испытуемого раствора и каждого из стандартных растворов при длине волны возбуждения 340 нм и длине волны испускания между 440 нм и 455 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения. Измеряют интенсивность флуоресценции указанных растворов только один раз, поскольку излучение снижает интенсивность флуоресценции.

Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации белка носит линейный характер. Строят график зависимости интенсивностей флуоресценции стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения калибровочной кривой. На основании калибровочной кривой и интенсивности флуоресценции испытуемого раствора определяют концентрацию белка в испытуемом растворе.

Калибровочный график строят каждый раз при приготовлении новых реактивов или использовании другого спектрофлуориметра, но не реже 1 раза в 3 мес.

Примечания:

Приготовление боратного буферного раствора. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 61,83 г борной кислоты и растворяют в воде и доводят рН до значения 10,4 при помощи раствора калия гидроксида. Объем раствора доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Приготовление исходного раствора фталальдегида. 1,20 г фталальдегида растворяют в 1,5 мл метанола, прибавляют 100 мл боратного буферного раствора и перемешивают. Прибавляют 0,6 мл 30 % раствора макрогол 23 лаурилового эфира (300 г/л) и перемешивают.

Хранят при комнатной температуре и используют в течение 3 недель.

Приготовление фталальдегидного реактива. К 5 мл исходного раствора фталальдегида прибавляют 15 мкл 2-меркаптоэтанола. Раствор следует готовить не менее чем за 30 мин перед использованием.

Используют в течение 24 часов.

Метод 7 (Определение белка по содержанию азота)

Определение белка по содержанию азота основано на том, что содержание азота в большинстве белков практически одинаково и может быть принято равным 16 %. По количеству найденного азота во взятой пробе рассчитывают содержание белка в лекарственном средстве, используя коэффициент пересчета азота на белок, равный 6,25.

На результаты определения будут оказывать влияние другие азотсодержащие вещества, присутствующие в испытуемом образце.

Методика определение белка по содержанию азота основана на разложении испытуемого образца в ходе проведения анализа, но не лимитирована содержанием белка в водной среде. При нагревании азотсодержащего органического соединения с серной кислотой концентрированной, азот превращается в аммония сульфат, который можно определить количественно.

Метод А (Метод Къельдаля)

Определение проводят в соответствии с требованиями, указанными  в ОФС «Определение азота в органических соединениях» (метод 2 – микрометод Къельдаля) из точной навески препарата, содержащей 10 – 20 мг белка. После минерализации азотсодержащего органического соединения с серной кислотой концентрированной азот превращается в аммония сульфат, который можно определить количественно.

Метод Б

Большинство приборов для определения азота используют пиролиз, то есть сжигание  образца в кислороде при температуре приблизительно 1000 °С, в ходе которого выделяется азота монооксид (NO) и другие оксиды азота (NOx), из азота присутствующего в испытуемом веществе. Некоторые приборы преобразуют оксиды азота в азот, который количественно определяется с помощью детектора по теплопроводности. В других приборах азота монооксид (NO) смешивается с озоном (О3)  для получения азота диоксида (NO2 *) в возбужденном состоянии, испускающего свет при распаде, который может быть количественно определен с помощью хемилюминесцентного детектора. Для оптимизации навески и параметров пиролиза и обеспечения стабильности показателей при проведении анализа используется стандартный образец соответствующей чистоты и подходящий по составу с исследуемому белку.

Расчеты. Концентрацию белка рассчитывают путем деления содержания азота в испытуемом образце на известное содержание азота в исследуемом белке. Известное содержание азота в белке можно определить исходя из химического состава белка или путем сравнения с подходящим стандартным образцом.

Скачать в PDF ОФС.1.2.3.0012.15 Определение белка

Поделиться ссылкой:

Определение онкопротеина р16ink4a

Иммуноцитохимическое исследование, позволяющее выявить экспрессию белка р16 (p16INK4a) на поверхности эпителиальных клеток. Белок р16 является биологическим маркером начала канцерогенеза – повышение его экспрессии наблюдается при предраковых изменениях и может рассматриваться как непрямой маркер активной онкогенной экспрессии ВПЧ высокого онкологического риска (выявляется при переходе ВПЧ из эписомальной формы в интегрированную). Определение экспрессии белка р16 позволяет с высокой точностью обнаружить риск развития рака шейки матки, своевременно поставить диагноз и назначить лечение. Определение уровня экспрессии позволяет выявить степень нарушения пролиферации, сопутствующей опухолевому росту, способность опухоли к инвазии и метастазированию.

Синонимы русские

Белок p16INK4a; иммуноцитохимическое исследование.

Синонимы английские

Оncoprotein p16INK4ain; immunocytochemical study.

Метод исследования

Иммуноцитохимический метод + жидкостная цитология.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Аспират из полости матки.

Общая информация об исследовании

Одной из самых современных методик ранней диагностики предраковых состояний является иммуноцитохимическое исследование — определение онкопротеина р16ink4a для оценки потенциала дисплазии эпителия.

Было доказано, что экспрессия онкопротеина р16ink4a связана с низкой, умеренной и тяжелой дисплазией (по цитологической классификации ВОЗ (CIN I, CIN II и CIN III) и цитологической классификации Бетесда (ASCUS, LSIL и HSIL), причем экспрессия онкопротеина р16ink4a не встречалась в плоском эпителии без признаков дисплазии. В норме кодируемый геном-супрессором белок p16INK4a блокирует вызываемую фактором роста стимуляцию деления клетки за счет угнетения циклин-зависимой киназы, что приводит к нарушению фосфорилирования белка ретинобластомы (БРБ). В этих условиях БРБ связывается с фактором транскрипции Е2F, блокирует его митотическую активность и останавливает деление клетки. Однако при ВПЧ инфекции встроенная в геном хозяина ДНК вируса начинает синтезировать два онкогена, Е6 и Е7. Онкоген Е7 связывается с белком ретинобластомы, препятствуя ингибированию E2F. Это приводит к неконтролируемому делению клетки и повышенному синтезу белка p16INK4a, что может быть зафиксировано с помощью цитоиммунохимической реакции.

В то же время, хотя отмечается четкая корреляция обнаружения ДНК вируса папилломы человека с дисплазиями, имеется также большое количество ПЦР-позитивных по HPV случаев (с эписомальной локализацией HPV), в которых при последующем гистологическом исследовании отсутствует предрак и рак. Это подтверждается негативной иммуноцитохимической реакцией на р16ink4a в диспластических клетках.

В данном исследовании применяется современная технология приготовления цитопрепаратов — жидкостная цитология. Важная особенность метода, повышающая качество исследования: исследуемый материал берется в специальный стабилизирующий раствор, который обеспечивает его сохранность без разрушения и потери клеток. При этом весь клеточный материал сохраняет без изменения свои морфологические и иммуноцитохимические свойства. В последние пять лет в разных странах проводилось много исследований, в которых сравнивалась эффективность традиционной техники и жидкостной цитологии с использованием для подтверждения диагнозов гистологической экспертизы как «золотого стандарта» и оценки цитопрепаратов согласно классификации TBS (The Bethesda System). Метод жидкостной  цитологии признан надежным лабораторным тестом, который снижает количество ложноотрицательных результатов, неудовлетворительных для анализа препаратов и время, необходимое цитологу для оценки препарата.

Материал для цитологического исследования получают с поверхности слизистой оболочки. Слизь, присутствующая во взятом материале, мешает перенести на мазок клетки, также материал невозможно равномерно перемешать. При переносе материала на стекло традиционным способом клетки области шейки матки могут не попасть в препарат, подсушивание и потеря прилипших к инструменту клеток значительно снижает диагностическую информативность микропрепаратов. Метод жидкостной цитологии позволяет исключить эти негативные факторы. Преимущество жидкостной цитологии состоит в том, что при взятии материала можно получить до 5-6 «серийных» (то есть одинаковых по клеточному составу) мазков. Это дает возможность применения дополнительных методов исследований.

Данное обследование может быть применено в диагностике поражения шейки матки, где это является наиболее частым и востребованным методом исследования. Оно может позволить:

  • достоверно оценивать потенциал дисплазии в отношении развития рака шейки матки и, соответственно, выбирать более консервативную или более агрессивную тактику лечения;
  • уточнять заключения цитолога — дополнительному исследованию на онкопротеина р16ink4a подлежат все случаи атипической цитологии (кроме инвазивного рака шейки матки), неопределенные цитологические заключения (атипические клетки плоского эпителия неясного значения-ASCUS) и все изменения железистого эпителия;
  • разрешать спорные вопросы при выявлении гинекологом высокоаномальной кольпоскопической картины, не сопровождающейся изменениями в цитологическом мазке;
  • во многих случаях обоснованно отказаться от биопсии — у большинства пациенток пожилого возраста с цитологической картиной дисплазии на фоне атрофического цервицита обоснованно избирать выжидательную тактику, отказавшись не только от лечения, но и от биопсий, и увеличить интервалы между диспансерными осмотрами; у небольшого числа р16ink4a-позитивных пациенток этой возрастной группы, напротив, обоснованно избрать более активную тактику;
  • определять индивидуальную тактику в отношении пациенток, инфицированных штаммами вируса папилломы человека  высокого онкогенного потенциала, если у них нет цитологических и кольпоскопических изменений; у женщин с позитивной ПЦР по HPV выделить группу пациенток, у которых уже инициирован канцерогенез в эпителии шейке матки, и направить на них необходимое лечебное воздействие; соответственно, в более многочисленной группе р16ink4a-негативных женщин необходимо продолжить мониторинг;
  • усовершенствовать мониторинг пациенток, прошедших органосохраняющее лечение по поводу «тяжелой дисплазии» или «рака in situ», добавив определение онкопротеина р16ink4a к рутинному цитологическому исследованию, это позволит у пациенток наибольшего риска повысить чувствительность цитологического исследования и тестировать персистирующую папиллома-вирусную инфекцию до появления морфологических изменений.

Для чего используется исследование?

  • Обследование женщин независимо от наличия или отсутствия патологии шейки матки;
  • обследование женщин и мужчин при подозрении на рак шейки матки, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы;
  • наличие патологии шейки матки;
  • контроль эффективности лечения патологии шейки матки

Когда назначается исследование?

  • При наличии клинико-анамнестических признаков (эрозия, лабораторно подтвержденное инфицирование ВПЧ), позволяющих заподозрить онкологический процесс в шеечной части матки, мочевого пузыря, прямой кишке;
  • все случаи атипической цитологии (кроме инвазивного рака шейки матки), неопределенные цитологические заключения (атипические клетки плоского эпителия неясного значения) и все изменения железистого эпителия;
  • при выявлении высокоаномальной кольпоскопической картины, не сопровождающейся изменениями в цитологическом мазке;
  • при наблюдении за пациентками, прошедшими органосохраняющее лечение по поводу «тяжелой дисплазии» или «рака in situ» в целях повышения чувствительности цитологического исследования.

Что означают результаты?

Референсные значения: отсутствие экспрессии белка р16 в клетках эпителия (негативная реакция).

Заключение включает в себя два подраздела: цитологическое описание и иммуноцитохимическое исследование на р16ink4a.

Цитологическое заключение интерпретируется в зависимости от выявления онкомаркера р16ink4a. В особенности это относится к дисплазиям шейки матки.

Белок р16(INK4a) осуществляет контроль разобщения комплекса E2F-Rb, препятствуя пролиферации клетки. В норме по механизму обратной связи синтез р16 сдерживается, таким образом, концентрация данного белка в нормальной клетке чрезвычайно мала, что проявляется негативной иммуноцитохимической реакцией.

Достоверно показано, что экспрессия р16 связана с низкой, умеренной и тяжелой дисплазией, причем экспрессия р16 практически не встречается в плоском эпителии без признаков дисплазии (0-2% случаев).

Экспрессия белка р16 нарастает с увеличением степени дисплазии и выявляется:

  • в 16% случаев при CIN I – плоскоклеточном интраэпителиальном поражении низкой степени тяжести – воспалительные изменения, характерные для инфекции ВПЧ, слабая дисплазия эпителия;
  • в 64% при CIN II — плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени тяжести – умеренная дисплазия эпителия;
  • в 90% случаев при CIN III — тяжелая дисплазия эпителия и внутриэпителиальный рак шейки матки;
  • в 100% при плоскоклеточном раке шейки матки.
 Скачать пример результата

Кто назначает исследование?

Гинеколог, онколог.

Также рекомендуется

[12-134] Определение предиктора изменений эндометрия PTEN, Ki67

[09-106] Human Papillomavirus высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы), ДНК генотипирование [реал-тайм ПЦР]

Литература

  • Аляутдина О.С., Синицына О.В. ЗНАЧЕНИЕ ТЕСТА НА ОНКОБЕЛОК Р16INK4A В АЛГОРИТМЕ ДИАГНОСТИКИ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2016. – № 11-1. – С. 58-60.
  • Ашрафян Л.А., Харченко Н.В., Огрызкова В.Л., Антонова И.Б. Принципы лечения премикроинвазивного рака шейки матки.// Практическая онкология. — 2002. — Том 3. — С. 173-178;17.
  • Бохман Я.В. Руководство по онкогинекологии./Я.В. Бохман. – С.-Пб. «Фолиант». 2002.
  • Н.В. Данилова, Ю.Ю. Андреева, с соавт. Маркеры апоптоза и белки-регуляторы клеточного цикла при фоновых и предраковых изменениях железистого эпителия шейки матки. Онкология. Журнал им. П.А. Герцена, 1, 2013.
  • Протасова А.Э. Клиническая оценка и фармако-экономический анализ диагностики и лечения основных злокачественных опухолей женских гениталий в амбулаторных условиях.Автореф. дис. д-ра мед. наук. СПб., 2011.
  • Сагайдак В.Н., Комарова Л.Е. Рак шейки матки и цитологический скрининг. – М. 1994.
  • Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2016. – № 11 (часть 1) – С. 58-60.
  • Сергеева Н.С., Маршутина Н.В. Новые серологические и уринологическиеопухолевые маркеры в уточняющей диагностике и мониторинге онкологических больных // Материалы VII Российской онкологической конференции. — М., 2003.
  • Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Современные представления о канцерогенезе рака шейки матки.//  Практическая онкология — 2002. — Том 3. — С. 145-155;18.
  • Экспрессия р53 в поверхностных уротелиальных карциномах мочевого пузыря – независимый фактор прогноза. М.В. Ковылина, Е.А. Прилепская, О.А. Цыбуля, Н.В. Тупикина, И.В. Рева.ОНКОУРОЛОГИЯ 2’2016. ТОМ 12.
  • Bibbo M., Klump W.J., DeCecco J., Kovatish A.J. Procedure for immunocytochemical detection of p16INK4A antigen in thin-layer, liquid-based specimens.// ActaCytol. — 2002. — V.46 — P. 25-29;15.
  • Jenison S.A., Yu X.P., Valentine J.M., Galloway D.A. Characterization of human antibody-reactive epitopes encoded by human papillomavirus types 16 and 18. //  J Virol. 1991 — V.65(3) — P. 1208-1218;1.
  • Klaes R., Froedrich T., Spitkovsky D. et al. Overexpression of p16(INK4A) as a specific marker for dysplastic and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri.// Int J Cancer. 2001 — V.92(2) — P.276-84;4.
  • Meyer J.L., Hanlon D.W., Andersen B.T. et al. Evaluation of p16INK4a expression in ThinPrep cervical specimens with the CINtec p16INK4a assay: correlation with biopsy follow-up results.// Cancer. — 2007. — V. 111(2). — P. 83-92;20.
  • Nieh S., Chen S.F., Chu T.Y. et al. Expression of p16 INK4A in Papanicolaou smears containing atypical squamous cells of undetermined significance from the uterine cervix. // Gynecol Oncol. — 2003. — V.91(1) — P.201-8;5.

Общий белок (суточная моча) (Protein total)

Что такое общий белок в суточной моче (Protein total)?

Определение общего белка в суточной моче (Protein total, urine) – это анализ, позволяющий измерить концентрацию белка, выделяемого почками с мочой в течение 24 часов.

В жидкой части крови (плазме) белки отвечают за перенос многих веществ к органам и тканям, а также за сохранение постоянного объема циркулирующей крови, то есть белки выполняют жизненно важные функции.

В норме кровь, проходя через почки, фильтруется специализированными структурами – клубочками с образованием первичной мочи, в которую попадают только белки небольшого размера. Затем эти белки возвращаются в кровоток (реабсорбируются) в канальцах почек, не сохраняясь во вторичной моче – той, которая выводится из организма. При нарушении работы почек в мочу могут попасть крупные белки или не реабсорбироваться мелкие. Обнаружение белка в моче называется протеинурией.

При повреждении клубочкового аппарата почек первым в мочу попадает белок альбумин.

Слишком большое содержание белка в крови также может привести к его попаданию в мочу, это наблюдается при злокачественных заболеваниях крови или лимфатической системы (миеломной болезни или множественной миеломе, лимфоме) и др.

Для чего определяют уровень общего белка в суточной моче?

Определение уровня общего белка в суточной моче используют для обнаружения заболеваний почек. Это крайне важно пациентам с сахарным диабетом и/или артериальной гипертонией, поскольку раннее обнаружение белка в моче позволяет скорректировать терапию основного заболевания и отсрочить проявления почечной недостаточности. Для этих целей также могут использоваться анализы на определение альбумина в моче (в разовой порции, в суточной моче).

Определение общего белка в суточной моче важно проводить беременным женщинам, у которых есть положительные результаты тестов на белок в разовых порциях мочи, поскольку наличие белка может свидетельствовать о преэклампсии.

В ряде случаев могут понадобиться другие тесты, например, на определение общего белка в плазме крови при массивной протеинурии, а также липидов крови для подтверждения нефротического синдрома.

При каких заболеваниях повышается уровень общего белка в суточной моче?

Уровень общего белка в суточной моче повышается при гломерулонефрите, нефротическом синдроме, сахарном диабете, гипертонической болезни, инфекционных заболеваниях мочеиспускательного тракта, множественной миеломе, лимфоме, тяжелой сердечной недостаточности, опухолевых заболеваниях мочевых путей, преэклампсии, системной красной волчанке, амилоидозе, синдроме Гудпасчера, отравлении тяжелыми металлами.

Почему результат анализа может быть некорректным?

На концентрацию общего белка в суточной моче могут влиять избыточные физические и эмоциональные нагрузки (сильный стресс), повышение температуры тела, воздействие холода, высокобелковая диета, прием некоторых лекарственных препаратов. Перед сдачей анализа необходимо обсудить с врачом, назначившим тест, особенности пищевого рациона и полный список принимаемых постоянно или периодически лекарственных препаратов и добавок к пище.

На результат теста могут влиять нарушения при сборе мочи, поэтому следует предварительно ознакомиться с инструкцией по сбору биоматериала.

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Единицы измерения: мг/сутки. 

Альтернативные единицы: г/сутки. 

Перевод единиц: г/сутки х 1000 ==> мг/сутки.

Референсные значения:

Повышение уровня:

  1. нефротический синдром;

  2. гломерулонефриты;

  3. диабетическая нефропатия;

  4. поражение почечных канальцев;

  5. инфекции мочевых путей;

  6. миелома;

  7. миелопролиферативные и лимфопролиферативные расстройства;

  8. гематурия;

  9. застойная сердечная недостаточность;

  10. опухоли мочевых путей;

  11. физическое напряжение (увеличение до 320 мг/сутки).

См.также: тест № 28 Общий белок (в крови).


Антитела, количественные, к спайковому (S) белку (RBD) SARS-CoV-2, IgG (Anti-SARS-CoV-2, spike (S) protein (RBD), IgG, quantitative)

Метод определения

Хемилюминесцентный иммуноанализ (технология Architect, Abbott. SARS-CoV-2 IgG II Quant), количественный тест.

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Для проведения исследования в медицинских офисах Москвы необходимо предъявить СНИЛС и документ удостоверяющий личность.

Синонимы: Анализ крови для количественного определения IgG-антител к спайковому (S) белку SARS-CoV-2; Количественное определение IgG антител к RBD домену S-белка SARS-CoV-2; IgG Антитела к коронавирусу SARS-CoV-2, включая нейтрализующие IgG; Тест на IgG антитела к спайковому (S) белку коронавируса; Антитела к рецептор-связывающему домену вируса, вызывающего COVID-19, Иммунитет к коронавирусу SARS-CoV-2; Антитела класса G к SARS-CoV-2 RBD; Анти-RBD антитела класса G. 

Antibodies to RBD domain of spike (S) protein SARS-CoV-2, IgG; Antibodies IgG for RBD SARS-CoV-2 spike (S) protein; IgG antibodies to SARS-CoV-2 RBD domain of spike (S) protein of SARS-CoV-2; Сoronavirus immunity. 

Диапазон количественного измерения: 2,9 — 5680 BAU/мл.

Общая информация об исследовании «Антитела, количественные, к спайковому (S) белку SARS-CoV-2, IgG» 

SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 – тяжелого острого респираторного синдрома коронавирус 2) – официальное наименование вируса, вызвавшего эпидемию COVID-19. COVID-19 (coronavirus disease 2019 – коронавирусная болезнь 2019) – название болезни, которую индуцирует новый вид коронавируса. 

Источником передачи инфекции SARS-CoV-2 является, в большинстве случаев, больной человек, в том числе находящийся в инкубационном периоде заболевания, который составляет от 2 до 14 (в среднем 5-7) дней. Клинические проявления могут быть аналогичны неспецифичным симптомам ОРВИ (повышение температуры, сухой кашель, затруднение дыхания). Дополнительные эпидемиологические признаки – вероятный либо подтвержденный контакт с больными COVID-19, а также проявления в виде пневмонии с характерными изменениями в легких по данным компьютерной томографии (КТ), свидетельствуют о высокой вероятности COVID-19.

SARS-CoV-2 стимулирует гуморальный и клеточный ответ иммунной системы инфицированного человека. Гуморальный ответ характеризуется продукцией антител IgM и IgG классов, которые способны специфически распознавать и связывать чужеродные белки, характерные для патогена, участвуя в механизмах его нейтрализации и удаления. Антитела класса IgM появляются первыми, через несколько дней от появления симптомов. Почти одновременно или вскоре вслед за ними появляются IgG (более, чем у половины пациентов в период 8-14 дней от возникновения клинических признаков инфекции, а в период от 15 дней и более – у 99% пациентов). По уровню и динамике концентрации антител в крови гуморальный иммунный ответ индивидуально варьирует, в том числе в зависимости от тяжести болезни. Уровень IgM снижается до неопределяемого обычно в пределах до одного, реже – двух месяцев от начала заболевания, в то время как IgG антитела могут сохраняться в крови длительное время (3-5 месяцев и более), выполняя защитную функцию. 

Четыре структурных белка, которые кодирует РНК вируса SARS-CoV-2, – это спайковый (S), оболочечный (E), нуклеокапсидный (N) и мембранный (M). Структуры, выступающие на поверхности вируса подобно шипам и придающие вириону сходство с короной, сформированы спайковым (S) белком. S-белок состоит из двух субъединиц (S1 и S2). Нуклеокапсидный и спайковый белки в ходе инфекции вызывают наиболее выраженный антительный ответ. При этом нейтрализующая активность антител, вырабатываемых против SARS-CoV-2, преимущественно соотносится с антителами к S-белку (который является главной мишенью в вакцинологии). На S1 субъединице этого белка располагается рецептор-связывающий домен (RBD), который способен прочно связываться с рецепторами ангиотензин-превращающего фермента (ACE2), расположенными на клетках различных тканей, в том числе на эпителии легочных альвеол. Взаимодействие RBD домена с рецепторами ACE2 является начальным этапом внедрения вируса в клетку. Антитела, специфически связывающиеся с RBD областью S1 субъединицы спайкового белка коронавируса, способны ингибировать его связывание с клеточными рецепторами, оказывая выраженный нейтрализующий эффект. 

С какой целью используют количественное определение уровня антител к спайковому (S) белку SARS-CoV-2, IgG 

Присутствие специфических антител к вирусу SARS-CoV-2 класса G указывает на факт недавнего или прошлого взаимодействия с вирусом. Поэтому такие тесты используют в комплексной диагностике при наличии подозрений на инфекцию новым коронавирусом или ее осложнения. Основной метод лабораторного подтверждения острой инфекции COVID-19 – выявление методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) РНК вируса в биоматериале, взятом из дыхательных путей, обычно в мазке из носоглотки и ротоглотки. Однако информативность РНК-тестирования зависит от достаточности содержания вируса в биоматериале выбранной локализации на той или иной стадии инфекции, а также качества взятия материала. Наиболее информативны ПЦР-исследования мазков из рото- и носоглотки в первые 1-5 дней от начала клинических проявлений инфекции. На более поздних сроках (более 1-2 недель) целесообразно дополнительно к ПЦР-тестированию мазков применять исследование крови на наличие специфических антител, вырабатываемых организмом в ответ на инфекцию SARS-CoV-2. 

Оценка уровня IgG антител к SARS-CoV-2 может использоваться также с целью выявления иммунологических свидетельств прошлой (в том числе субклинической или бессимптомной) инфекции для оценки вероятного иммунного статуса обследуемого человека по отношению к этому вирусу, прослеживания контактов, популяционных эпидемиологических исследований. 

Поскольку большинство зарегистрированных и разрабатываемых вакцин против SARS-CoV-2 нацелено на антитела к S-белку, количественное определение уровня IgG антител к SARS-CoV-2 S-белку (RBD) может быть информативным методом оценки динамики иммунного ответа на вакцинацию такими препаратами (в частности, для оценки ответа на применение вакцины Гам-КОВИД-Вак – «Спутник V»), Спутник Лайт, а также цельновирионных инактивированных вакцин (в том числе – КовиВак производства ФНЦ им. М.П. Чумакова) или вакцин на основе мРНК S-белка. Тест не применим для оценки иммунитета после вакцинации вакциной ЭпиВакКорона)).

Следует отметить, что результаты предлагаемого теста количественного исследования IgG антител к SARS-CoV-2 S-белку (RBD), независимо от используемой антигенной мишени, нельзя считать прямым методом определения нейтрализующих антител, поскольку оценка нейтрализующей активности антител требует специальных методов, малодоступных для рутинного практического использования. Но результаты этого теста проявляют очень высокую корреляцию с результатами тестов нейтрализации при проведении параллельных исследований. 

Когда (спустя какой срок) можно определять уровень антител к спайковому (S) белку SARS-CoV-2, IgG после вакцинации

Оценка напряженности поствакцинального протективного иммунитета должна проводиться с использованием тест-систем, специфичных к наличию S-белка или RBD домену S-белка вируса SARS-CoV-2, не ранее чем на 42-й день после первого этапа вакцинации.

Литература

  1. Временные методические рекомендации. Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19). Версия 11 (07.05.2021). МЗ РФ.
  2. Диагностическое тестирование для определения вируса SARS-CoV-2. Временные рекомендации. 11 сентября 2020. ВОЗ.
  3. <Письмо> Минздрава России от 28.12.2020 № 1/и/1-9601 «О порядке проведения вакцинации против COVID-19 взрослому населению».
  4. Bohn M. K. et al. IFCC interim guidelines on serological testing of antibodies against SARS-CoV-2 //Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). – 2020. – Т. 58. – №. 12. – С. 2001-2008.
  5. Li X. et al. Lu Sh //Molecular immune pathogenesis and diagnosis of COVID-19, J Pharmaceutical Analysis. – 2020. – Т. 10. – №. 2. – С. 102-8.
  6. Lippi G., Horvath A. R., Adeli K. Editorial and executive summary: IFCC Interim Guidelines on clinical laboratory testing during the COVID-19 pandemic //Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). – 2020. – Т. 58. – №. 12. – С. 1965-1969.
  7. Okba N. M. A. et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2− specific antibody responses in coronavirus disease patients //Emerging infectious diseases. – 2020. – Т. 26. – №. 7. – С. 1478-1488.
  8. Walls A. C. et al. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein //Cell. – 2020. – Т. 181. – №. 2. – С. 281-292. e6.
  9. Материалы фирмы-производителя реагентов.
  10. Письмо Росздравнадзора (РЗН) от 05.07.2021 «О международном формате оценки уровня иммуноглобулинов, в том числе IgG, к SARS-CoV-2»

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Дифференциальная сканирующая флуориметрия продемонстрировала свою силу в качестве надежной и универсальной метода для характеристики белков, и выявления потенциальных лигандов белка. Хорошо задокументированные успехи в ускорении стабилизации белка, лекарств (особенно в менее финансируемых лабораторий) и кристаллизация 10,23-25 ​​сделали его привлекательным методом для начального скрининга соединений. Соединения, добавленные к белкам показывают четкое зависимое от дозы увеличение кажущейся температурой плавления 7,9. Тем не менее, не было сделано попытки использовать результаты этих экспериментов, чтобы определить, кажущиеся константы связывания, чтобы помочь в рейтинге соединений на их сродство. Здесь мы представляем метод для определения систематически кажущуюся константу диссоциации белков в присутствии лиганда.

Представленные здесь результаты показывают, что DSF могут быстро и решительно дают оценки константы диссоциации дляСочетание белок-лиганд. Наблюдаемые данные можно манипулировать с коммерчески доступных инструментов, чтобы обеспечить быстрое определение Уб, без необходимости делать предположения относительно вероятной стоимости параметров. Этот метод имеет существенное преимущество по сравнению с сопоставимыми некоторых методов быть экономной в белка и времени, необходимого. Эксперимент, описанный здесь будет потреблять 0,13 мг белка на эксперименте (приблизительно 0,4 мг для экспериментов повторяются в трех экземплярах). Это выгодно отличает изотермический титрования калориметрии (ITC), где один эксперимент со средним 40 кДа белка будет потреблять такое же количество. Полный набор экспериментов, необходимых для этого протокола будет потреблять около 4 ч, в том числе подготовки, для одного набора экспериментов. Опять же, это, вероятно, будет значительно быстрее, чем методы, такие как ITC или поверхностного плазмонного резонанса, который, пока мощная часто требуют существенной оптимизации для достижения наилучших данных.

Наши результаты показывают, что остается требование, чтобы внимательно изучить исходные данные, пригодный этих данных для определения температуры плавления, и подходят данных температуры плавления, чтобы определить константу диссоциации. Первая задача заключается в форме исходных данных, полученных при плавлении белка. В некоторых случаях, форма не может приблизиться к тому, что наблюдалось на фиг.1А. Общие вопросы включают низкие сдвиги температуры на связывание лиганда, высокий фоновой флуоресценции и необычные множественные переходы температуры. Низкие сдвиги температуры наблюдаются на связывание ряд лигандов. Для этого метода, наиболее важным параметром является ошибка в измерении Т м, по сравнению со сдвигом температуры. Данные могут быть установлены, как правило, достаточно хорошо, когда стандартное отклонение трех измерений не превышает 10% от температуры плавления сдвигом между несвязанного и полностью связанного белка. Наш опыт показывает, что там, где такие температурыратуре сдвиги только 2 ° С, это может быть достаточным для подгонки данных, если отдельные точки данных с высокой точностью. Второй вопрос заключается в необычной формы кривых. Они часто отличаются от свободного белка и лиганда, связанного форм, как связывания лиганда влияет на раскрытие режимы белка. В этих случаях, пользователь должен рассмотреть вопрос о том, что данные могут быть использованы с соответствующим учетом моделей, которые будут использоваться для определения температуры плавления и константу диссоциации. Еще одна распространенная проблема в том, что добавление кофактора к белку (например, MgCl 2 в нашем примере с гексокиназой) требуется для получения наиболее достоверных данных. Наш опыт показывает, что тщательное рассмотрение всех вероятных факторов в эксперименте на стадии принятия начальные показания необходимо получение наилучших результатов. Кроме того, альтернативные теоретические методы лечения могут выявить особенности этих данных 15,17. Наконец, это не редкость для некоторых белков, которые сontain изначально подвергается гидрофобные участки, чтобы показать высокий фоновой флуоресценции. Есть ряд решений этих проблем, которые были широко отзывы других 6,9.

В частности, пользователь должен рассмотреть вопрос о том, чтобы использовать Больцмана или его производные модели (например, фиг.4), и в случае использования производных, независимо от того, должны быть смоделированы несколько расплавов. Эти два метода моделирования тепловой разворачивается отличаются тем, что метод Больцмана подходит экспериментальные данные для уравнения Больцмана, предполагая регулярное сигмоидального форму к разворачивающейся кривой. В отличие от этого, производное метод принимает первую производную экспериментальных данных в каждой точке (нижняя панель на фиг.1А), и считает температуру плавления, чтобы быть самой высокой точкой первой производной. Производное метод возвращает как правило, более высокую температуру плавления примерно на 2 — 3 ° С. Большинство белков вернется более последовательнымРезультат (то есть, стандартная ошибка температуры плавления для тройных опытах ниже) для одного из двух методов. Это, как правило, тесно связаны с точной формы разворачивания белка кривую, и надо эмпирически определить наилучший метод в каждом конкретном случае. Там, где используется производная модель, важно также рассмотреть несколько событий плавления. Некоторые данные ясно показывают доказательства для нескольких переходов, и в этих случаях результаты, скорее всего, будет легче определить, если эти несколько событий плавления моделируются. В контексте этого протокола, то это часто бывает, что добавление лиганда может вызвать белок перейти от наличия нескольких переходов плавления к одному перехода (например, путем стабилизации наиболее термически хрупкий субдомен), или наоборот. Поэтому мы бы посоветовали, что исходные данные рассматриваются вместе, прежде чем рассматривать, какой подход будет лучше всего использовать.

После мodelling отдельных температур плавления, дальнейшие проблемы могут возникнуть в связи с настройкой их на модели, представленные в разделе протокола. Крайне важно, чтобы внимательно изучить подгонку к константы диссоциации уравнения, используя логарифмическую шкалу, как этот анализ часто подчеркивает расхождения между данными наблюдений и модели (е .g., Рисунок 3). Хотя полученные результаты, как правило, надежные, уход в интерпретации дает возможность извлекать лучшие результаты, а самое значение, в соответствии с данными.

Особым вопросом поднят этих данных является интерпретация, что должен быть сделан на белки, которые показывают кооперативности или нескольких обязательных мероприятий, в DSF. Мы, на сегодняшний день, только наблюдали это явление в белках, которые, как ожидается, несколько специфических связывающих события (например, WCBM, белок, лучше гомолог является мультимер 26, и который выступает в качестве мультимера на гель-фильтрации [данных неПоказано]). Это не совсем понятно, что отрицательный кооперативности наблюдается в DSF денатурации указывает на то, что фермент будет в конечном счете, показывают отрицательную кооперативность: а, это может быть показателем комплекс связывания, которые должны быть изучены более детально с использованием широкого спектра методов. Это позволяет предположить, к нам, однако, что более обширные исследования таких белков, вероятно, определить интересные эффекты.

Значения, приведенные для константы диссоциации, используя этот метод, как правило, из того же порядка, предоставленные другими методами, такими как изотермический титрования калориметрии и поверхностного плазмонного резонанса. Тем не менее, абсолютные значения, наблюдаемые часто выше, чем наблюдаемые с помощью этих методов. Это, по меньшей мере, частично является следствием того факта, что константа диссоциации наблюдается при температуре плавления белка с лигандом. Это Уб как правило, выше, чем при физиологических температурах. DissociatioN константа в зависимости от температуры реакции с помощью уравнений:

[1]

[2]

(Где с θ является стандартной ссылкой концентрация, Δ гG является Гиббс изменение свободной энергии реакции, R является газовая постоянная, Δ H является изменение энтальпии в реакции, и Δ S является изменение энтропии в реакции .)

Реакции с константы диссоциации в измеряемого диапазона этого метода, как правило, имеют отрицательный Δ RG, и поэтому эффект увеличения температуры на уравнения [1] будет увеличить константу диссоциации. Оба Δ H и Δ S термины, которые составляют свободную энергию Гиббса (уравнение [2]) являются TEMPERATURе зависит 27, и эффект от константы диссоциации будет зависеть от величины и знака этих температурных зависимостей, и обязательно будет зависеть взаимодействие. Следовательно, это не является неожиданным, что константы диссоциации, определенные с помощью этого метода, иногда больше, чем те, которые определены с помощью методов, которые работают при комнатной температуре. Температурная зависимость, конечно, также предостережение многих других методов, которые, как правило, чтобы обеспечить константу диссоциации при температурах более низких, чем физиологической температуре.

Другой предостережение метода DSF является то, что меченый метод, в отличие от ITC. Флуоресцентной метки использовали (SYPRO оранжевый) является гидрофобным, и поэтому в некоторых случаях может конкурировать со связыванием гидрофобных лигандов с белками. Следовательно, вполне вероятно, что в некоторых случаях, константа диссоциации получены будет поднят искусственно вследствие конкуренции с меткой. Однако, для сравнения различных лигандов, (основное применениеDSF), различия вряд ли достаточно значимы, чтобы влиять на ранжирование соединений близостью.

Потенциальным недостатком этого способа является пределом обнаружения, что может быть достигнуто. В принципе, это не должно быть возможным точно измерить значение K D, которая ниже, чем 50% от концентрации белка, и даже значения в этом диапазоне может быть сомнительной точности. В то время как предел обнаружения на этом конце диапазона может быть продлен немного за счет снижения концентрации белка и красителя, чувствительность прибора позволит предотвратить дальнейшее снижение концентрации белка. Кроме того, верхний конец чувствительности будет определяться растворимости лиганда. Для получения математически надежную оценку для K D, очень важно, чтобы получить данные с 90% белка, присутствующего в лиганд-связанной форме, которая требует концентрации лиганда с приблизительнолы в десять раз Уб (при условии отсутствия кооперативности). Предел обнаружения будет поэтому обязательно одна десятая растворимости лиганда в соответствующем буфере. Это означает, что пределы обнаружения метода, как правило, в диапазоне от 1 мкм и от 1 до 100 мм, в зависимости от белка и лиганда.

В заключение, дифференциальная сканирующая флуориметрия является универсальным метод применим к широкому диапазону белков. Используя методы, представленные здесь, можно быстро и недорого определить сродство белка при различных лигандов. Это имеет большой потенциал для применения в очистке белков и стабилизации, выяснения функции или специфичности ферментов из метагеномов, и в разработке лекарств, особенно в небольших лабораториях.

Определение белка — имеет значение метод

3.2. Непрямое определение белка

3.2.1. Содержание белка на основе определения азота

Некоторые из наиболее часто используемых методов определения пищевого белка основаны на анализе общего содержания азота в образцах. Примерами таких методов являются метод Дюма [21] и метод Кьельдаля [15]. В обоих методах общий азот в образце выделяется при высокой температуре. В методе Кьельдаля азот выделяется в сильную кислоту, и ее содержание измеряется после нейтрализации и титрования.В методе Дюма азот выделяется в газообразной форме и определяется детектором теплопроводности после удаления диоксида углерода и водных аэрозолей. Метод Кьельдаля был выбран в качестве примера этого аналитического принципа в данном исследовании, поскольку он до сих пор признан AOAC International в качестве официального метода определения пищевого белка [14]. После определения азота содержание сырого протеина рассчитывается с использованием коэффициента пересчета. Первоначальный и до сих пор часто используемый коэффициент преобразования 6.25 основан на предположении, что общее содержание азота в пищевых белках составляет 16% и что весь азот в пищевых продуктах связан с белками. Однако это довольно грубые предположения, поскольку относительное содержание азота варьируется между аминокислотами, а аминокислотный состав варьируется между пищевыми белками [22]. Кроме того, широкий спектр других соединений, таких как нитрат, аммиак, мочевина, нуклеиновые кислоты, свободные аминокислоты, хлорофиллы и алкалоиды, содержат азот. Эти соединения называются небелковым азотом, и их относительное содержание в овощах часто выше, чем в продуктах животного происхождения [5].На протяжении многих лет было доказано, что коэффициент преобразования 6,25 в большинстве случаев переоценивает содержание белка, и для корректировки этих изменений было предложено несколько коэффициентов преобразования для конкретных видов [6,7,16,22], в результате чего преобразование азота в белок более точное.

3.2.2. Сравнение аминокислотного анализа и метода Кьельдаля

Приведены результаты аминокислотного анализа и анализа Кьельдаля сырья.Представлены как традиционный коэффициент преобразования 6,25, так и соответствующие коэффициенты преобразования для конкретных видов. Для рыбы, креветок и муки в этих расчетах использовались видоспецифические факторы, представляющие собой средние коэффициенты пересчета, предложенные Mariotti et al. [7], а именно 5,6 для рыбы и креветок и 5,4 для злаков. Коэффициент преобразования, используемый для dulse, — это коэффициент, предложенный Lourenço et al. [16] как среднее значение для красных водорослей, а именно 4,59.

Таблица 1

Содержание белка по результатам аминокислотного анализа и анализа азота по методу Кьельдаля в треске, лососе, креветках, белой и цельнозерновой муке и дульсе (красные водоросли).

Сырье
Виды Аминокислотный анализ Кьельдаль (фактор 6,25) Кьельдаль (факторы, зависящие от вида)
Треска 111,6 ± 9,1 35 a 185,7 ± 15,0 b 166,4 ± 13,4 b (5,6)
Лосось 121,4 ± 6,3 a 208,1 ± 7,3 c 186.5 ± 6,6 b (5,6)
Креветки 83,8 ± 8,6 a 132,7 ± 4,7 c 117,8 ± 4,4 b (5,6)
Белая мука (пшеничная) 77,9 ± 6,5 a 117,6 ± 7,3 c 101,6 ± 6,3 b (5,4)
Цельная мука (пшеничная) 88,2 ± 3,8 a 133,4 ± 7,8 С 115.3 ± 6,8 b (5,4)
Дульсе (красные водоросли) 105,3 ± 9,1 a 152,1 ± 10,0 b 111,7 ± 7,3 a (4,59)

Как и ожидалось, все результаты Кьельдаля с использованием традиционного коэффициента преобразования были значительно выше, в диапазоне от 44% до 71% выше, чем соответствующие результаты аминокислотного анализа. Что еще более удивительно, за исключением красных водорослей, видоспецифические коэффициенты преобразования также дали значительно более высокое содержание белка, чем аминокислотный анализ.Одно из возможных объяснений может заключаться в том, что концентрация некоторых аминокислот в образце была снижена в результате процесса гидролиза перед анализом аминокислот, и что концентрация белка, рассчитанная на основе этого анализа, на самом деле была занижена. Другое возможное объяснение может заключаться в том, что «реальные» коэффициенты пересчета для этих видов на самом деле должны быть даже ниже, чем средние значения, указанные Mariotti et al. [7]. Расчет коэффициентов пересчета на основе результатов этого исследования дал коэффициент 4.9 для рыбы и креветок и 4,7 для муки соответственно.

Существуют риски, связанные с вычислением протеина по азоту и, как следствие, завышенной оценкой содержания протеина. Одним из них является возможность фальсификации продуктов питания, поскольку высокое содержание белка часто повышает экономическую ценность продукта [23]. Были случаи, когда производители для увеличения кажущегося содержания белка [24] и, следовательно, экономической ценности пищевого продукта добавляли небелковый азот, такой как меламин.Это может поставить под угрозу безопасность пищевых продуктов для потребителей, и, следовательно, важно, чтобы такая фальсификация пищевых продуктов была невозможна. Другой риск заключается в том, что потенциал использования и экономическая целесообразность «нового» сырья могут быть переоценены, поскольку белок является одним из компонентов продукта с потенциалом создания добавленной стоимости. Таким образом, переоценка может дать ложные предпосылки для создания новых производств. Например, за последние десятилетия значительно возрос интерес к промышленному использованию морских водорослей.Несколько исследований показали, что содержание белка в некоторых видах красных морских водорослей составляет 30–45% [25,26], тогда как при анализе с помощью аминокислотного анализа оно обычно колеблется от 10% до 20% [11,27,28]. Такая разница может иметь решающее значение для экономики малых предприятий.

3.2.3. Спектрофотометрические методы и экстракция белков

Третьим распространенным аналитическим методом анализа белков является спектрофотометрия. Здесь принцип заключается в том, что функциональные группы или области в белке поглощают свет в ультрафиолетовом или видимом диапазоне электромагнитного спектра (200-800 нм).Это поглощение считывается и сравнивается с известными стандартами белка. Примерами таких функциональных групп или областей являются основные группы, ароматические группы, пептидные связи или агрегированные белки.

Хотя и азотный, и аминокислотный анализ можно проводить без какой-либо предварительной обработки сырья, экстракция белков является предварительным условием перед отправкой материала на спектрофотометрический анализ. Также для экстракции белка существует множество методов. Наиболее распространенные протоколы экстракции белков основаны на воздействии на ткань слабых буферов или воды, что приводит к коллапсу клеток с последующим высвобождением внутриклеточных белков в ответ на возникающий гипотонический шок.Это очень эффективно для тканей, содержащих клетки без клеточных стенок (клетки животных), но не так эффективно для клеток с клеточными стенками (клетки растений). Последнее связано с клеточными стенками, защищающими клетку от коллапса [29]. В это исследование были включены как источники белка животного происхождения, так и источники белка растительного происхождения, чтобы оценить эти различия.

Одним из наиболее распространенных методов экстракции белков, особенно перед электрофорезом, является использование так называемых буферов Гуда, ряда буферов, впервые описанных в 1966 г. Good et al.[8]. Эти буферы содержат химические вещества с цвиттерионными свойствами, а также один или несколько детергентов и, как известно, хорошо совместимы с биологическими анализами. Они хорошо растворимы в воде, обладают низким солевым действием и минимальным вмешательством в биологические функции [10]. Главный недостаток этих протоколов состоит в том, что они включают несколько дорогостоящих химикатов, и некоторые из них предположительно наносят вред здоровью. В этом исследовании смесь HEPES (цвиттерионный агент) и CHAPS (детергент) была выбрана в качестве примера этого принципа.

Белки часто делятся на четыре основных класса в зависимости от их свойств растворимости. Четыре класса — это водорастворимые альбумины, глобулины, растворимые в слабых ионных растворах, глютелины, растворимые в слабокислых или основных растворах, и проламины, растворимые в 70% этаноле. Большинство пищевых продуктов представляют собой сложные матрицы, вероятно, содержащие несколько из этих классов белков и объединение нескольких растворенных веществ, вероятно, оптимизирует выход экстракции. В Mæhre et al. [9] было показано, что объединение H 2 O, 0.1 M NaOH и 3,5% NaCl при повышенной температуре увеличивали выход экстракции по сравнению с традиционными методами экстракции, поэтому в данном исследовании этот метод был выбран в качестве примера более простого метода экстракции белка.

In, выходы экстракции двух различных методов экстракции представлены как содержание белка по отношению к соответствующему сырью, рассчитанное после аминокислотного анализа. Как видно, экстракция белков с использованием протокола HEPES / CHAPS была совершенно неэффективной, что приводило к очень низким выходам для всего сырья.Было показано, что солевая / щелочная экстракция дает значительно более высокие выходы для всего сырья. Кроме того, было показано, что протокол «соль / щелочь» был очень эффективным для экстракции белков животного происхождения, позволяя извлечь более или менее 100% белка. Он также был достаточно эффективным для извлечения белков из высоко переработанного растительного сырья (белой муки), давая выход около 80%. Однако выход экстракции был ниже в менее обработанных и более сложных растительных материалах, таких как цельнозерновая мука и дульсе, причем последнее сопоставимо с предыдущим исследованием [9].

Таблица 2

Выходы экстракции белка рассчитаны на основе аминокислотного анализа трески, лосося, креветок, белой и цельнозерновой муки и дульса.

Сырье
Виды Выход экстракции Соль / щелочь Выход экстракции HEPES / CHAPS
Треска 106,8 ± 11,2 b 13,8 ± 3,0 a 900
Лосось 99.9 ± 13,3 b 31,9 ± 2,1 a
Креветки 113,3 ± 17,0 b 14,4 ± 2,2 a
Белая пшеничная мука 78,5 ± 11,1 b 15,0 ± 3,7 a
Цельнозерновая мука 66,1 ± 20,9 b 20,4 ± 3,2 a
Dulse (красные водоросли) 34,9 ± 6.7 b 12,0 ± 1,6 a

Одно из различий между двумя выбранными методами экстракции состояло в том, что солевую / щелочную экстракцию проводили при 60 ° C, а HEPES / CHAPS проводили на льду, и это могло вносят свой вклад в разницу в выходе извлечения. Экстракция на льду, вероятно, защищает белки от разложения, тогда как термическая обработка может ускорить это. Таким образом, метод экстракции следует выбирать исходя из цели дальнейшего использования.Однако в этом исследовании цель состояла в том, чтобы просто изучить различия в выходе экстракции белка между методами, и, таким образом, деградация белка не анализировалась.

После экстракции было протестировано определение белка с использованием двух различных спектрофотометрических методов, метода Брэдфорда [18] и модифицированного метода Лоури [17], которое сравнивалось с аминокислотным анализом. В методе Брэдфорда краситель Кумасси G-250 реагирует с ионизируемыми группами на белке, нарушая третичную структуру белков и обнажая гидрофобные карманы.За этим следует связывание красителя с гидрофобными аминокислотами с образованием стабильных комплексов, которые можно считывать при 595 нм [3]. Модифицированный метод Лоури представляет собой комбинацию метода Биурета, где ионы меди реагируют с пептидными связями в белке, и реакции между реагентом Фолина-Чокальтеу и кольцевой структурой ароматических аминокислот. Полная реакция образует стабильный комплекс темно-синего цвета, который можно прочитать при 650–750 нм [3].

3.2.4. Сравнение аминокислотного анализа и спектрофотометрических методов

In, результаты определения белка с помощью аминокислотного анализа, метода Брэдфорда и модифицированного метода Лоури показаны для солевых / щелочных экстрактов, а в тех же анализах показаны для HEPES / CHAPS. экстракты.В солевых / щелочных экстрактах как метод Брэдфорда, так и модифицированный метод Лоури дали более высокие оценки белка, чем аминокислотный анализ белков животного происхождения. То же самое наблюдалось при использовании модифицированного метода Лоури для растительных белков, в то время как метод Брэдфорда давал такие же или более низкие оценки белка, чем аминокислотный анализ. В экстрактах HEPES / CHAPS было невозможно получить какие-либо результаты с использованием модифицированного метода Лоури. Метод Брэдфорда дал более высокие оценки белка, чем аминокислотный анализ для всего сырья, за исключением дульса.

Таблица 3

Содержание белка рассчитано на основе аминокислотного анализа, анализа Брэдфорда и модифицированного анализа Лоури в солевых / щелочных белковых экстрактах трески, лосося, креветок, белой и цельнозерновой муки и дульсе.

Солевые / щелочные белковые экстракты
Виды Аминокислотный анализ Брэдфорд Модифицированный Лоури
Треска 118,8 ± 9,8 a 198.7 ± 24,1 b 194,5 ± 11,4 b
Лосось 120,9 ± 13,9 a 234,6 ± 10,6 c 211,9 ± 9,2 b
Креветки 93,9 ± 7,8 a 165,5 ± 10,3 b 151,2 ± 8,2 b
Белая мука (пшеничная) 60,9 ± 8,1 b 45,0 ± 6,6 a 85 .7 ± 12,3 c
Цельная мука (пшеничная) 58,2 ± 18,6 a 46,2 ± 18,5 a 88,8 ± 27,3 b
Dulse (красные водоросли) 36,9 ± 9,1 a 48,4 ± 3,9 a 89,5 ± 15,9 b

Таблица 4

Содержание белка рассчитано на основе аминокислотного анализа, анализа Брэдфорда и модифицированного анализа Лоури в белке HEPES / CHAPS экстракты трески, лосося, креветок, белой и цельнозерновой муки и дульсе.

Белковые экстракты HEPES / CHAPS
Виды Аминокислотный анализ Брэдфорд Модифицированный Лоури
Треска 15,3 ± 2,7 a 39,4 ± 7,5 b 900 н.о.
Лосось 38,7 ± 3,3 a 98,4 ± 3,1 b n.a.
Креветки 11.9 ± 0,7 a 25,7 ± 1,6 b нет данных
Мука белая (пшеничная) 11,6 ± 2,7 a 18,5 ± 3,9 b n.a.
Цельная мука (пшеничная) 18,0 ± 2,8 a 30,0 ± 5,0 b n.a.
Дульсе (красные водоросли) 12,5 ± 1,4 b 7,8 ± 1,3 a n.а.

Метод Лоури широко используется для определения белка в течение многих десятилетий благодаря своей простоте и доступности. Однако, помимо ароматических аминокислот, с реагентом Фолина – Чокальтеу вступает в реакцию целый ряд других соединений [30]. В сложных пищевых матрицах, содержащих несколько мешающих соединений, это обычно приводит к завышению содержания белка, что также показывают результаты солевой / щелочной экстракции. Одним из соединений, которое, как было показано, мешает протоколу Лоури, является HEPES [31].В этом исследовании реакция между буфером HEPES / CHAPS и реагентом Лоури дала очень сильный фоновый цвет как в стандартах, так и в экстрактах, что сделало невозможным получение точных результатов по белку. Обычно считается, что метод Брэдфорда менее подвержен таким помехам. Однако результаты этого исследования показывают, что также для некоторых видов сырья оценки белка очень высоки по сравнению с аминокислотным анализом, что указывает на то, что может быть какое-то вмешательство.Возможным объяснением также может быть разница в эффективности экстракции разных аминокислот. В анализе Брэдфорда основные аминокислоты вносят больший вклад в окончательный цвет, чем другие аминокислоты [3], в то время как ароматические аминокислоты вносят больший вклад в развитие цвета в модифицированном методе Лоури. Как видно на фиг., Имелись некоторые существенные различия в эффективности экстракции между гидрофобными (пролин, глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин и фенилаланин), ароматическими (тирозин, фенилаланин, триптофан и гистидин) и основными (лизин, гистидин и аргинин) аминокислоты.Однако этот эффект варьировался между видами, и единственный значительный эффект при рассмотрении всех материалов заключался в том, что метод HEPES / CHAPS, по-видимому, извлекал гидрофобные аминокислоты более эффективно, чем другие методы.

Таблица 5

Относительное количество гидрофобных, ароматических и основных аминокислот (АК) в сырье и белковых экстрактах после экстракции с использованием HEPES / CHAPS и соли / щелочи в треске, лососе, креветках, белой пшеничной муке, цельнозерновой муке и dulse, как и у всех видов.

Сырье HEPES / CHAPS Соль / щелочь
Треска Гидрофобный AA 37,8 ± 0,9 ab 42,8 ± 3,2 b 35,7 ± 1,3 a
Ароматический АА 9,3 ± 1,7 9,4 ± 2,4 8,0 ± 2,7
Основной АА 19,6 ± 0,3 19,2 ± 1,2 18.7 ± 0,6
Лосось Гидрофобный AA 39,4 ± 1,0 a 44,3 ± 1,0 b 39,5 ± 1,6 a
Ароматический AA 10,1 ± 1,4 9,0 ± 3,3 8,7 ± 3,0
Basic AA 20,0 ± 0,2 18,2 ± 1,4 20,0 ± 3,1
Креветки Гидрофобные AA 38,4 ± 0,4 a 47.3 ± 1,2 b 38,0 ± 2,5 a
Ароматический AA 10,2 ± 0,9 b 4,2 ± 0,9 a 8,7 ± 2,1 b
Базовый AA 19,8 ± 0,2 b 17,6 ± 1,1 a 19,8 ± 0,7 b
Белая мука (пшеничная) Гидрофобная AA 41,2 ± 0,9 b 40.5 ± 1,4 b 37,4 ± 0,6 a
Ароматический AA 8,9 ± 1,1 a 9,4 ± 2,7 ab 11,5 ± 0,5 b
Basic AA 8,6 ± 0,3 a 11,0 ± 0,5 b 7,9 ± 0,7 a
Цельная мука (пшеничная) Гидрофобный AA 40,9 ± 0,5 b 38.6 ± 0,6 a 40,0 ± 1,7 ab
Ароматический AA 9,4 ± 1,1 10,6 ± 0,3 8,1 ± 2,2
Basic AA 10,2 ± 0,2 b 12,4 ± 0,5 c 8,4 ± 0,4 a
Dulse (красные водоросли) Hydrophobic AA 43,5 ± 1,4 b 34,6 ± 2,7 a 46,3 ± 2.3 b
Ароматический AA 10,3 ± 0,5 b 1,6 ± 0,2 a 9,3 ± 1,8 b
Basic AA 14,0 ± 1,7 c 4,4 ± 0,8 a 6,9 ± 0,7 b
Все виды Гидрофобный AA 40,2 ± 2,1 ab 41,4 ± 4,5 b 39,5 ± 3,8 a
Ароматический AA 9.7 ± 1,2 7,4 ± 3,8 9,1 ± 2,3
Basic AA 15,4 ± 4,8 13,8 ± 5,4 13,6 ± 6,2

Обзор методов анализа белков | Thermo Fisher Scientific

Количественное определение концентрации белка является неотъемлемой частью любого лабораторного рабочего процесса, включающего экстракцию, очистку, маркировку или анализ белка. Тесты Pierce Protein Assays предоставляют широкий спектр возможностей для точного определения концентрации белка на основе времени анализа, чувствительности, совместимости, линейности стандартной кривой и вариации от белка к белку.Хотя в этой статье в качестве примеров используются продукты Pierce Protein Assay, обсуждаемые принципы и химический состав в целом применимы к большинству доступных колориметрических или флуорометрических методов анализа белка.

Вступление

Количественное определение белка часто необходимо перед обработкой образцов белка для выделения, разделения и анализа с помощью хроматографических, электрофоретических и иммунохимических методов. В зависимости от требуемой точности, количества и чистоты доступного белка для определения концентрации белка подходят разные методы.

Самый простой и самый прямой метод определения концентрации белка в растворе — это измерение оптической плотности при 280 нм (УФ-диапазон). Аминокислоты, содержащие ароматические боковые цепи (т. Е. Тирозин, триптофан и фенилаланин), обладают сильным поглощением УФ-света. Белки и пептиды поглощают УФ-свет пропорционально содержанию в них ароматических аминокислот и общей концентрации. Другой метод, традиционно используемый в аминокислотном анализе с помощью ВЭЖХ, заключается в маркировке всех первичных аминов (т.е.е., N-конец и боковая цепь остатков лизина) с цветным или флуоресцентным красителем, таким как нингидрин или о-фталевый альдегид (OPA). Подходы с прямым поглощением УФ-света и реагентами для ВЭЖХ имеют особые недостатки, которые делают эти методы непрактичными для использования с типичными образцами белков в рабочих процессах протеомики. Метод УФ-поглощения не идеален для белковых смесей, поскольку разные белки имеют разное содержание ароматических аминокислот, что приводит к разным характеристикам поглощения. Кроме того, любое небелковое вещество, поглощающее УФ-свет, будет мешать измерениям.

Для преодоления этих недостатков было разработано несколько колориметрических и флуоресцентных методик анализа белков на основе реагентов, которые используются почти в каждой лаборатории, занимающейся исследованиями белков. К реагенту добавляют образцы белка, вызывая изменение цвета или усиление флуоресценции пропорционально добавленному количеству. Концентрацию белка определяют по стандартной кривой, состоящей из известных концентраций очищенного эталонного белка. Эти методы анализа белка можно разделить на две группы в зависимости от типа химии.

Таблица 1. Типы, преимущества, недостатки и примеры методов определения белка.

Метод Преимущества Недостатки Пример реагентов для анализа
Поглощение УФ-излучения
  • Простой, не требует каких-либо реагентов для анализа
  • 45847
    с белком смеси или сложные образцы (например, клеточные лизаты)
Биуретовые методы: Хелатирование белка и меди и вторичное обнаружение восстановленной меди
  • Совместимость с большинством поверхностно-активных веществ (детергентов)
  • Кривая линейного отклика (R2 > 0.95)
  • Меньшая вариабельность белок-белок по сравнению с анализами на основе красителя Кумасси
  • Несовместимость с веществами, снижающими медь
  • Несовместимость с обычными восстанавливающими агентами, такими как DTT
Анализ BCA
Анализ Лоури 18
Методы на основе колориметрических красителей: Связывание белков с красителями и прямое определение изменения цвета
  • Быстро и легко выполнять
  • Выполняется при комнатной температуре
  • Совместим с большинством солей, растворителей, буферов, тиолов, восстанавливающих веществ, и металл-хелатирующие агенты
  • Несовместимость с поверхностно-активными веществами (детергентами)
  • Высокая вариабельность белок-белок по сравнению с анализами на основе меди
Bradford (Coomassie)
Методы флуоресцентных красителей: -связывание красителя и прямое обнаружение увеличения флуоресценции как связан со связанным красителем
  • Превосходная чувствительность, требуется меньше образца белка для количественного определения
  • Время не является критическим фактором, поэтому анализы могут быть адаптированы для автоматизированной обработки в высокопроизводительных приложениях
  • Требуется специализированное оборудование
флуоресцентный анализ EZQ
Qubit Protein Assay

Выбор анализа белка

Ни один реагент не может считаться идеальным или лучшим методом анализа белка.У каждого метода есть свои преимущества и недостатки. Выбор среди доступных анализов белка обычно основан на совместимости метода анализа белка с образцами. Кроме того, необходимо учитывать потенциальные мешающие вещества, включенные в образцы, которые могут повлиять на определенные методы анализа, а также на точность, воспроизводимость и желаемое время инкубации. Следовательно, успешное использование анализов белка включает выбор метода, который наиболее совместим с анализируемыми образцами, выбор подходящего стандарта анализа, а также понимание и контроль конкретных допущений и ограничений, которые остаются.

Цель состоит в том, чтобы выбрать метод, который требует минимальных манипуляций или предварительной обработки образцов для размещения веществ, которые мешают анализу. У каждого метода есть свои преимущества и недостатки. Поскольку ни один реагент не может считаться идеальным или лучшим методом анализа белка при любых обстоятельствах, большинство исследователей имеют в своих лабораториях более одного типа анализа белка.

Важные критерии для выбора анализа включают:
  • Совместимость с типом образца и компонентами
  • Диапазон анализа и требуемый объем образца
  • Однородность белка к белку (см. Ниже)
  • Скорость и удобство для количества образцов подлежит тестированию
  • Наличие спектрофотометра или планшет-ридера, необходимого для измерения цвета (оптической плотности) при анализе

Некоторые распространенные вещества, которые потенциально мешают методам анализа белка, являются восстанавливающими агентами (например,я. DTT) и моющие средства (например, Triton X-100). Как правило, образцы, содержащие восстанавливающие агенты или хелатирующие медь агенты, предпочтительно анализируются с помощью анализов на основе красителя Кумасси (метод Брэдфорда). Это связано с тем, что анализы на основе красителя Кумасси, такие как анализы Пирса Кумасси (Брэдфорд) и Пирса Кумасси Плюс (Брэдфорд), совместимы с восстанавливающими агентами и не требуют реакций связывания медь-белок. Для тех образцов, которые содержат детергенты, лучше всего подходят анализы белков на основе меди, такие как анализ BCA Pierce Rapid Gold, поскольку они не ингибируются малыми или умеренными количествами детергента.

Помимо совместимости образцов, анализы белка также обычно группируются по диапазону концентраций белка, которые они могут обнаружить. Для образцов, в которых ожидается низкая концентрация белка (<20 мкг / мл), может потребоваться использование альтернативного протокола анализа на микропланшете или специализированного анализа, такого как анализ белка Pierce Micro BCA, который специально разработан для разбавленные образцы. Если общая концентрация белка в образцах высока (> 2000 мкг / мл), часто можно использовать разбавление образца для решения любых проблем, связанных с известными мешающими веществами.Иногда образец содержит вещества, которые делают его несовместимым с любым из методов анализа белка. Предпочтительный метод борьбы с этими типами мешающих веществ — просто удалить их.

Анализ белков BCA Pierce Rapid Gold и анализ белка Кумасси (Брэдфорд) дополняют друг друга и обеспечивают два основных метода анализа большинства образцов. Различные дополнительные реагенты и альтернативные версии этих двух анализов позволяют удовлетворить многие другие потребности в образцах.


Выбор стандарта белка

Поскольку белки различаются по своему аминокислотному составу, каждый из них по-разному реагирует на каждый тип анализа белка. Следовательно, лучший выбор для эталонного стандарта — это очищенная, известная концентрация белка, наиболее распространенного в образцах. Обычно этого невозможно достичь, и это редко бывает удобно или необходимо. Во многих случаях цель состоит в том, чтобы просто оценить общую концентрацию белка, и небольшая вариабельность между белками является допустимой.

Если высокоочищенная версия интересующего белка недоступна или слишком дорога для использования в качестве стандарта, альтернативой является выбор белка, который будет давать очень похожую кривую цветового отклика в выбранном методе анализа белка и легко доступны для любой лаборатории в любое время. Как правило, бычий сывороточный альбумин (БСА) хорошо подходит для стандарта белка, поскольку он широко доступен в высокой чистоте и относительно недорого. В качестве альтернативы, бычий гамма-глобулин (BGG) является хорошим стандартом при определении концентрации антител, поскольку BGG дает кривую цветового ответа, которая очень похожа на кривую иммуноглобулина G (IgG).

Для максимальной точности оценки общей концентрации белка в неизвестных образцах важно включать стандартную кривую каждый раз при проведении анализа. Это особенно верно для методов анализа белка, которые дают нелинейные стандартные кривые. Выбор количества стандартов и повторов, используемых для определения стандартной кривой, зависит от степени нелинейности стандартной кривой и требуемой степени точности. Как правило, для построения стандартной кривой требуется меньше точек, если цветовая характеристика линейна.Обычно стандартные кривые строятся с использованием как минимум двух повторов для каждой точки кривой.


Подготовка проб для анализа белка

Перед анализом образца на общее содержание белка его необходимо растворить, обычно в забуференном водном растворе. Часто принимаются дополнительные меры предосторожности, чтобы подавить рост микробов или избежать случайного загрязнения образца посторонними предметами, такими как пыль, волосы, кожные или телесные масла.

В зависимости от исходного материала, который используется в процедурах перед проведением анализа белка, образец будет содержать множество небелковых компонентов.Знание этих компонентов имеет решающее значение для выбора подходящего метода анализа и оценки причины аномальных результатов. Например, ткани и клетки обычно лизируются буферами, содержащими поверхностно-активные вещества (детергенты), биоциды (антимикробные агенты) и ингибиторы протеаз. Также могут быть включены различные соли, денатурирующие агенты, восстанавливающие агенты и хаотропы. После фильтрации или центрифугирования для удаления клеточного мусора типичные образцы по-прежнему будут включать нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые соединения.

На каждый тип анализа белка неблагоприятно влияют вещества того или иного вида. Компоненты белкового раствора считаются мешающими веществами в анализе белка, если они искусственно подавляют ответ, усиливают ответ или вызывают повышенный фон на произвольно выбранную степень (например, на 10% по сравнению с контролем).

Неточность из-за небольшого количества мешающего вещества может быть устранена путем приготовления стандарта белка в том же буфере, что и анализируемый белок.Для более высоких, несовместимых уровней мешающих веществ необходимы другие стратегии:

  • Выберите другой метод анализа белка или версию того же метода анализа, которая включает компоненты для преодоления помех.
  • Диализ или обессоливание пробы для удаления мелких мешающих веществ (т.е. менее 1000 дальтон), таких как восстановители.
  • Осаждение белка в TCA или другом подходящем реагенте, удаление раствора, содержащего мешающий компонент, и затем повторное растворение белка для анализа.На этой иллюстрации представлен обзор того, как методы диализа белка используются для удаления веществ, которые могут загрязнять образцы белка и мешать последующим применениям.

Рис. 1. На схеме показано, как диализную кассету можно использовать для очистки белка. 3 мл 1 мг / мл IgG в 0,1 М трис-буфере, pH 7, внутри диализной кассеты помещают в 1000 мл 100 мМ PBS с pH 7,6. Старый диализат удаляют и заменяют 1000 мл 100 мМ PBS с pH 7.6. IgG слишком велик для проникновения в поры мембраны; следовательно, количество IgG внутри кассеты остается постоянным. Концентрация Трис-буфера внутри кассеты падает ниже 0,01 М по мере диффузии Трис-буфера и диффузии буфера PBS. Опять же, старый диализат отбрасывается и заменяется 1000 мл 100 мМ PBS с pH 7,6. IgG внутри кассеты остается постоянным. Уровень трис-буфера внутри кассеты падает почти до неопределяемого уровня. Буфер внутри кассеты представляет собой 100 мМ PBS с pH 7.6.


Различия между белками

Каждый белок в образце отвечает уникальным образом в данном анализе белка. Такое изменение от белка к белку относится к различиям в степени окраски (оптической плотности), получаемой при одновременном анализе одной и той же массы различных белков одним и тем же методом. Эти различия в цветовой реакции связаны с различиями в аминокислотной последовательности, изоэлектрической точке (pI), вторичной структуре и присутствием определенных боковых цепей или простетических групп.

В зависимости от типа образца и цели проведения анализа, вариация от белка к белку является важным фактором при выборе метода анализа белка и при выборе подходящего стандарта анализа (например, BSA по сравнению с BGG). Методы анализа белков, основанные на аналогичном химическом составе, имеют схожие вариации от белка к белку.

Рисунок 2. Стандартные кривые. Примеры стандартных кривых с использованием очищенного BSA и BGG с набором для анализа белков Pierce BCA Protein Assay Kit, иллюстрирующие различия в интенсивности окраски двух разных белков.


Вариация белково-белковых анализов на белок

Протеиновые анализы различаются по своей химической основе для обнаружения специфичных для белков функциональных групп. Некоторые методы анализа обнаруживают пептидные связи, но ни один анализ не делает этого исключительно. Вместо этого каждый анализ белка обнаруживает одну или несколько различных конкретных аминокислот с большей чувствительностью, чем другие. Следовательно, белки с различным аминокислотным составом дают окраску с разной скоростью или интенсивностью в любом данном анализе белка.

В следующей таблице сравнивается вариабельность цветового ответа от белка к белку в нескольких анализах протеина Thermo Scientific Pierce. Эти данные служат в качестве общего руководства для оценки различий в ответах между образцами белка. Однако, поскольку сравнения проводились с использованием одной концентрации белка и буфера, их не следует использовать в качестве точных калибровочных коэффициентов.

Эта информация о вариабельности полезна при выборе стандарта белка. Например, когда анализируемый образец представляет собой очищенное антитело, бычий гамма-глобулин (BGG, белок № 5) будет более точным стандартом, чем бычий сывороточный альбумин (BSA, белок № 1).Эти данные также указывают на важность определения того, какой стандарт анализа использовался при сообщении результатов анализа белка.

Для каждого из представленных здесь анализов белков было проанализировано 14 белков с использованием стандартного протокола пробирки. Было рассчитано чистое (скорректированное на холостое значение) среднее поглощение для каждого белка. Чистое поглощение для каждого белка выражается как отношение к чистому поглощению для BSA (например, отношение 0,80 означает, что белок дает 80% цвета, полученного для эквивалентной массы BSA).Все концентрации белка составляли 1000 мкг / мл, за исключением анализа Micro BCA, концентрация которого составляла 10 мкг / молоко.

Таблица 2. Обзор протеиновых анализов.

66 0,27

Среднее соотношение

6-9 9

131066 1,18 Яичный альбумин

Результаты BCA
(Примечание 1)
Micro
BCA
Модифицированный
Lowry
Coomassie

плюс 908
Pierce
660 нм
Относительная однородность Высокая Высокая Высокая Средняя Низкая (Примечание 2) Низкая
Коэффициент вариации 14.7% 11,4% 11,9% 28,8% 38,2% 37%
Стандартное отклонение 0,15 0,12 0,13 0,21 0,26 1,02 1,05 1,09 0,73 0,68 0,74
Протестированные белки
1. Альбумин, бычья сыворотка 1.00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
2. Альдолаза, мышца кролика 0,85 0,80 0,94 0,74 0,76

66 0,83 альфа-химотрипсиноген

1,14 0,99 1,17 0,52 0,48
4. Цитохром С, сердце лошади 0,83 1.11 0,94 1,03 1,07 1,22
5. Гамма-глобулин, бычий 1,11 0,95 1,14 0,58 0,56 0,51

36

1,21 1,12 1,29 0,63 0,58
7. IgG, человеческий 1,09 1,03 1,13 0,66 0.63 0,57
8. IgG, мышь 1,18 1,23 1,20 0,62 0,59 0,48
9. IgG, кролик 1,12 1,12 0,43 0,37 0,38
10. IgG, овцы 1,17 1,14 1,28 0,57 0,53
11. Инсулин, поджелудочная железа КРС. 08 1,22 1,12 0,67 0,60 0,81
12. Миоглобин, сердце лошади 0,74 0,92 0,90 1,15 1,19 0,93 1,08 1,02 0,68 0,32 0,54
14. Трансферрин, человеческий 0,89 0,98 0.92 0,90 0,84 0,8
15. Альфа-лактальбумин 0,82
36 16. Лизоцим 0,79
17. Ингибитор трипсина, соя 0,38
Вариация от белка к белку анализов Thermo Scientific Pierce Protein Assays Примечания:
1.Анализ совместимости с восстанавливающими агентами (BCA-RAC) также показал низкий коэффициент вариации.
2. Анализ протеинов Bio-Rad Bradford, протестированный с теми же белками, что и наш анализ Кумасси (Брэдфорд), показал очень высокий коэффициент вариации (46%), соответствующий очень низкой относительной однородности.

Расчеты и анализ данных

В большинстве анализов белка концентрации белка в образце определяются путем сравнения их результатов анализа с ответами на серию разведений стандартов, концентрации которых известны.Образцы белка и стандарты обрабатываются таким же образом, смешивая их с реагентом для анализа и используя спектрофотометр для измерения оптической плотности. Отклики стандартов используются для построения или расчета стандартной кривой. Затем значения абсорбции неизвестных образцов интерполируются на график или формулу для стандартной кривой для определения их концентраций.

Очевидно, что наиболее точные результаты возможны только тогда, когда неизвестные и стандартные образцы обрабатываются одинаково.Это включает их анализ в одно и то же время и в одних и тех же буферных условиях, если это возможно. Поскольку задействованы различные этапы дозирования, повторения необходимы, если кто-то хочет рассчитать статистику (например, стандартное отклонение, коэффициент вариации) для учета случайной ошибки.

Рис. 3. Сравнение стандартных кривых для двухточечной и линейной аппроксимации. Интерполяция и расчет для исследуемого образца, имеющего оптическую плотность 0,6, приводят к значительно разным значениям концентрации белка.В этом случае метод «точка-точка» явно обеспечивает более точную контрольную линию для расчета тестового образца.

Хотя большинство современных спектрофотометров и планшет-ридеров имеют встроенное программное обеспечение для анализа данных анализа белков, технические специалисты часто неправильно понимают некоторые факторы. Потратив несколько минут на изучение и правильное применение принципов, задействованных в этих расчетах, можно значительно расширить возможности разработки анализов, дающих наиболее точные результаты (см. Соответствующие технические советы и ссылки).

Количественный анализ пептидов

Для рабочих процессов, использующих протеомику с использованием масс-спектрометрии, важно измерять концентрацию пептидов после этапов расщепления, обогащения и / или очистки C18, чтобы нормализовать вариации от образца к образцу. В частности, для экспериментов, использующих изобарическое мечение, очень важно гарантировать, что равные количества образца помечены перед смешиванием, чтобы получить точные результаты.

Подобно методам анализа белков, доступны различные варианты определения концентрации пептидов.Исторически для измерения концентраций пептидов применялись методы анализа белков в УФ-видимой области (A280) или колориметрические реагенты. Часто используются анализы BCA и микро-BCA. Хотя эти стратегии хорошо работают с образцами белков, эти реагенты не предназначены для точного определения пептидов. Альтернативно, количественные анализы пептидов — в колориметрическом или флуорометрическом формате — доступны для специфического количественного определения смесей пептидов. При выборе формата колориметрического или флуорометрического анализа на микропланшете для количественного анализа пептидов необходимо учитывать следующие важные критерии:

  • Совместимость с типом образца, компонентами и рабочими процессами
  • Диапазон анализа и требуемый объем образца
  • Скорость и удобство для количество образцов для тестирования
  • Наличие спектрофотометра или флуорометра, необходимого для измерения результатов анализа

Эти репрезентативные данные сравнивают результаты, полученные с помощью колориметрических и флуорометрических анализов.

Рис. 4. Количественное сравнение колориметрического и флуориметрического анализа пептидов. Триптические пептидные гидролизаты получали из двенадцати клеточных линий. Концентрации перевариваемых пептидов определяли с использованием количественного колориметрического анализа пептидов Thermo Scientific Pierce и наборов для количественного флуориметрического анализа пептидов Pierce в соответствии с инструкциями. Каждый образец анализировали в трех экземплярах, и концентрацию каждого гидролизата рассчитывали по стандартной кривой, построенной с использованием стандарта анализа протеинового переваривания.


Рекомендуемая литература

  1. Брэдфорд, ММ. (1976) Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах, использующий принцип связывания белок-краситель. Аналитическая биохимия. 72, 248-254.
  2. Смит П.К., Крон Р.И., Хермансон Г.Т. и др. (1987) Измерение белка с использованием бицинхониновой кислоты. Аналитическая биохимия. 150, 76-85.
  3. Крон, Р.И. (2002). Колориметрическое определение и количественное определение общего белка, Current Protocols in Cell Biology, A.3H.1-A.3H.28, John Wiley & Sons, Inc.
  4. Krohn, R.I. (2001). Колориметрическое определение общего белка, Текущие протоколы аналитической химии пищевых продуктов, B1.1.1-B1.1.27, John Wiley & Sons, Inc.
  5. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., et al. (1951) Измерение белка с помощью реагента фолин-фенол. Журнал биологической химии. 193, 265-75.
  6. Legler G, Müller-Platz CM, Mentges-Hettkamp M, et al. (1985) На химической основе определения белка Лоури.Аналитическая биохимия. 150, 278-87.

Статьи по Теме

Обзор методов анализа белков | Thermo Fisher Scientific

Количественное определение концентрации белка является неотъемлемой частью любого лабораторного рабочего процесса, включающего экстракцию, очистку, маркировку или анализ белка. Тесты Pierce Protein Assays предоставляют широкий спектр возможностей для точного определения концентрации белка на основе времени анализа, чувствительности, совместимости, линейности стандартной кривой и вариации от белка к белку.Хотя в этой статье в качестве примеров используются продукты Pierce Protein Assay, обсуждаемые принципы и химический состав в целом применимы к большинству доступных колориметрических или флуорометрических методов анализа белка.

Вступление

Количественное определение белка часто необходимо перед обработкой образцов белка для выделения, разделения и анализа с помощью хроматографических, электрофоретических и иммунохимических методов. В зависимости от требуемой точности, количества и чистоты доступного белка для определения концентрации белка подходят разные методы.

Самый простой и самый прямой метод определения концентрации белка в растворе — это измерение оптической плотности при 280 нм (УФ-диапазон). Аминокислоты, содержащие ароматические боковые цепи (т. Е. Тирозин, триптофан и фенилаланин), обладают сильным поглощением УФ-света. Белки и пептиды поглощают УФ-свет пропорционально содержанию в них ароматических аминокислот и общей концентрации. Другой метод, традиционно используемый в аминокислотном анализе с помощью ВЭЖХ, заключается в маркировке всех первичных аминов (т.е.е., N-конец и боковая цепь остатков лизина) с цветным или флуоресцентным красителем, таким как нингидрин или о-фталевый альдегид (OPA). Подходы с прямым поглощением УФ-света и реагентами для ВЭЖХ имеют особые недостатки, которые делают эти методы непрактичными для использования с типичными образцами белков в рабочих процессах протеомики. Метод УФ-поглощения не идеален для белковых смесей, поскольку разные белки имеют разное содержание ароматических аминокислот, что приводит к разным характеристикам поглощения. Кроме того, любое небелковое вещество, поглощающее УФ-свет, будет мешать измерениям.

Для преодоления этих недостатков было разработано несколько колориметрических и флуоресцентных методик анализа белков на основе реагентов, которые используются почти в каждой лаборатории, занимающейся исследованиями белков. К реагенту добавляют образцы белка, вызывая изменение цвета или усиление флуоресценции пропорционально добавленному количеству. Концентрацию белка определяют по стандартной кривой, состоящей из известных концентраций очищенного эталонного белка. Эти методы анализа белка можно разделить на две группы в зависимости от типа химии.

Таблица 1. Типы, преимущества, недостатки и примеры методов определения белка.

Метод Преимущества Недостатки Пример реагентов для анализа
Поглощение УФ-излучения
  • Простой, не требует каких-либо реагентов для анализа
  • 45847
    с белком смеси или сложные образцы (например, клеточные лизаты)
Биуретовые методы: Хелатирование белка и меди и вторичное обнаружение восстановленной меди
  • Совместимость с большинством поверхностно-активных веществ (детергентов)
  • Кривая линейного отклика (R2 > 0.95)
  • Меньшая вариабельность белок-белок по сравнению с анализами на основе красителя Кумасси
  • Несовместимость с веществами, снижающими медь
  • Несовместимость с обычными восстанавливающими агентами, такими как DTT
Анализ BCA
Анализ Лоури 18
Методы на основе колориметрических красителей: Связывание белков с красителями и прямое определение изменения цвета
  • Быстро и легко выполнять
  • Выполняется при комнатной температуре
  • Совместим с большинством солей, растворителей, буферов, тиолов, восстанавливающих веществ, и металл-хелатирующие агенты
  • Несовместимость с поверхностно-активными веществами (детергентами)
  • Высокая вариабельность белок-белок по сравнению с анализами на основе меди
Bradford (Coomassie)
Методы флуоресцентных красителей: -связывание красителя и прямое обнаружение увеличения флуоресценции как связан со связанным красителем
  • Превосходная чувствительность, требуется меньше образца белка для количественного определения
  • Время не является критическим фактором, поэтому анализы могут быть адаптированы для автоматизированной обработки в высокопроизводительных приложениях
  • Требуется специализированное оборудование
флуоресцентный анализ EZQ
Qubit Protein Assay

Выбор анализа белка

Ни один реагент не может считаться идеальным или лучшим методом анализа белка.У каждого метода есть свои преимущества и недостатки. Выбор среди доступных анализов белка обычно основан на совместимости метода анализа белка с образцами. Кроме того, необходимо учитывать потенциальные мешающие вещества, включенные в образцы, которые могут повлиять на определенные методы анализа, а также на точность, воспроизводимость и желаемое время инкубации. Следовательно, успешное использование анализов белка включает выбор метода, который наиболее совместим с анализируемыми образцами, выбор подходящего стандарта анализа, а также понимание и контроль конкретных допущений и ограничений, которые остаются.

Цель состоит в том, чтобы выбрать метод, который требует минимальных манипуляций или предварительной обработки образцов для размещения веществ, которые мешают анализу. У каждого метода есть свои преимущества и недостатки. Поскольку ни один реагент не может считаться идеальным или лучшим методом анализа белка при любых обстоятельствах, большинство исследователей имеют в своих лабораториях более одного типа анализа белка.

Важные критерии для выбора анализа включают:
  • Совместимость с типом образца и компонентами
  • Диапазон анализа и требуемый объем образца
  • Однородность белка к белку (см. Ниже)
  • Скорость и удобство для количества образцов подлежит тестированию
  • Наличие спектрофотометра или планшет-ридера, необходимого для измерения цвета (оптической плотности) при анализе

Некоторые распространенные вещества, которые потенциально мешают методам анализа белка, являются восстанавливающими агентами (например,я. DTT) и моющие средства (например, Triton X-100). Как правило, образцы, содержащие восстанавливающие агенты или хелатирующие медь агенты, предпочтительно анализируются с помощью анализов на основе красителя Кумасси (метод Брэдфорда). Это связано с тем, что анализы на основе красителя Кумасси, такие как анализы Пирса Кумасси (Брэдфорд) и Пирса Кумасси Плюс (Брэдфорд), совместимы с восстанавливающими агентами и не требуют реакций связывания медь-белок. Для тех образцов, которые содержат детергенты, лучше всего подходят анализы белков на основе меди, такие как анализ BCA Pierce Rapid Gold, поскольку они не ингибируются малыми или умеренными количествами детергента.

Помимо совместимости образцов, анализы белка также обычно группируются по диапазону концентраций белка, которые они могут обнаружить. Для образцов, в которых ожидается низкая концентрация белка (<20 мкг / мл), может потребоваться использование альтернативного протокола анализа на микропланшете или специализированного анализа, такого как анализ белка Pierce Micro BCA, который специально разработан для разбавленные образцы. Если общая концентрация белка в образцах высока (> 2000 мкг / мл), часто можно использовать разбавление образца для решения любых проблем, связанных с известными мешающими веществами.Иногда образец содержит вещества, которые делают его несовместимым с любым из методов анализа белка. Предпочтительный метод борьбы с этими типами мешающих веществ — просто удалить их.

Анализ белков BCA Pierce Rapid Gold и анализ белка Кумасси (Брэдфорд) дополняют друг друга и обеспечивают два основных метода анализа большинства образцов. Различные дополнительные реагенты и альтернативные версии этих двух анализов позволяют удовлетворить многие другие потребности в образцах.


Выбор стандарта белка

Поскольку белки различаются по своему аминокислотному составу, каждый из них по-разному реагирует на каждый тип анализа белка. Следовательно, лучший выбор для эталонного стандарта — это очищенная, известная концентрация белка, наиболее распространенного в образцах. Обычно этого невозможно достичь, и это редко бывает удобно или необходимо. Во многих случаях цель состоит в том, чтобы просто оценить общую концентрацию белка, и небольшая вариабельность между белками является допустимой.

Если высокоочищенная версия интересующего белка недоступна или слишком дорога для использования в качестве стандарта, альтернативой является выбор белка, который будет давать очень похожую кривую цветового отклика в выбранном методе анализа белка и легко доступны для любой лаборатории в любое время. Как правило, бычий сывороточный альбумин (БСА) хорошо подходит для стандарта белка, поскольку он широко доступен в высокой чистоте и относительно недорого. В качестве альтернативы, бычий гамма-глобулин (BGG) является хорошим стандартом при определении концентрации антител, поскольку BGG дает кривую цветового ответа, которая очень похожа на кривую иммуноглобулина G (IgG).

Для максимальной точности оценки общей концентрации белка в неизвестных образцах важно включать стандартную кривую каждый раз при проведении анализа. Это особенно верно для методов анализа белка, которые дают нелинейные стандартные кривые. Выбор количества стандартов и повторов, используемых для определения стандартной кривой, зависит от степени нелинейности стандартной кривой и требуемой степени точности. Как правило, для построения стандартной кривой требуется меньше точек, если цветовая характеристика линейна.Обычно стандартные кривые строятся с использованием как минимум двух повторов для каждой точки кривой.


Подготовка проб для анализа белка

Перед анализом образца на общее содержание белка его необходимо растворить, обычно в забуференном водном растворе. Часто принимаются дополнительные меры предосторожности, чтобы подавить рост микробов или избежать случайного загрязнения образца посторонними предметами, такими как пыль, волосы, кожные или телесные масла.

В зависимости от исходного материала, который используется в процедурах перед проведением анализа белка, образец будет содержать множество небелковых компонентов.Знание этих компонентов имеет решающее значение для выбора подходящего метода анализа и оценки причины аномальных результатов. Например, ткани и клетки обычно лизируются буферами, содержащими поверхностно-активные вещества (детергенты), биоциды (антимикробные агенты) и ингибиторы протеаз. Также могут быть включены различные соли, денатурирующие агенты, восстанавливающие агенты и хаотропы. После фильтрации или центрифугирования для удаления клеточного мусора типичные образцы по-прежнему будут включать нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые соединения.

На каждый тип анализа белка неблагоприятно влияют вещества того или иного вида. Компоненты белкового раствора считаются мешающими веществами в анализе белка, если они искусственно подавляют ответ, усиливают ответ или вызывают повышенный фон на произвольно выбранную степень (например, на 10% по сравнению с контролем).

Неточность из-за небольшого количества мешающего вещества может быть устранена путем приготовления стандарта белка в том же буфере, что и анализируемый белок.Для более высоких, несовместимых уровней мешающих веществ необходимы другие стратегии:

  • Выберите другой метод анализа белка или версию того же метода анализа, которая включает компоненты для преодоления помех.
  • Диализ или обессоливание пробы для удаления мелких мешающих веществ (т.е. менее 1000 дальтон), таких как восстановители.
  • Осаждение белка в TCA или другом подходящем реагенте, удаление раствора, содержащего мешающий компонент, и затем повторное растворение белка для анализа.На этой иллюстрации представлен обзор того, как методы диализа белка используются для удаления веществ, которые могут загрязнять образцы белка и мешать последующим применениям.

Рис. 1. На схеме показано, как диализную кассету можно использовать для очистки белка. 3 мл 1 мг / мл IgG в 0,1 М трис-буфере, pH 7, внутри диализной кассеты помещают в 1000 мл 100 мМ PBS с pH 7,6. Старый диализат удаляют и заменяют 1000 мл 100 мМ PBS с pH 7.6. IgG слишком велик для проникновения в поры мембраны; следовательно, количество IgG внутри кассеты остается постоянным. Концентрация Трис-буфера внутри кассеты падает ниже 0,01 М по мере диффузии Трис-буфера и диффузии буфера PBS. Опять же, старый диализат отбрасывается и заменяется 1000 мл 100 мМ PBS с pH 7,6. IgG внутри кассеты остается постоянным. Уровень трис-буфера внутри кассеты падает почти до неопределяемого уровня. Буфер внутри кассеты представляет собой 100 мМ PBS с pH 7.6.


Различия между белками

Каждый белок в образце отвечает уникальным образом в данном анализе белка. Такое изменение от белка к белку относится к различиям в степени окраски (оптической плотности), получаемой при одновременном анализе одной и той же массы различных белков одним и тем же методом. Эти различия в цветовой реакции связаны с различиями в аминокислотной последовательности, изоэлектрической точке (pI), вторичной структуре и присутствием определенных боковых цепей или простетических групп.

В зависимости от типа образца и цели проведения анализа, вариация от белка к белку является важным фактором при выборе метода анализа белка и при выборе подходящего стандарта анализа (например, BSA по сравнению с BGG). Методы анализа белков, основанные на аналогичном химическом составе, имеют схожие вариации от белка к белку.

Рисунок 2. Стандартные кривые. Примеры стандартных кривых с использованием очищенного BSA и BGG с набором для анализа белков Pierce BCA Protein Assay Kit, иллюстрирующие различия в интенсивности окраски двух разных белков.


Вариация белково-белковых анализов на белок

Протеиновые анализы различаются по своей химической основе для обнаружения специфичных для белков функциональных групп. Некоторые методы анализа обнаруживают пептидные связи, но ни один анализ не делает этого исключительно. Вместо этого каждый анализ белка обнаруживает одну или несколько различных конкретных аминокислот с большей чувствительностью, чем другие. Следовательно, белки с различным аминокислотным составом дают окраску с разной скоростью или интенсивностью в любом данном анализе белка.

В следующей таблице сравнивается вариабельность цветового ответа от белка к белку в нескольких анализах протеина Thermo Scientific Pierce. Эти данные служат в качестве общего руководства для оценки различий в ответах между образцами белка. Однако, поскольку сравнения проводились с использованием одной концентрации белка и буфера, их не следует использовать в качестве точных калибровочных коэффициентов.

Эта информация о вариабельности полезна при выборе стандарта белка. Например, когда анализируемый образец представляет собой очищенное антитело, бычий гамма-глобулин (BGG, белок № 5) будет более точным стандартом, чем бычий сывороточный альбумин (BSA, белок № 1).Эти данные также указывают на важность определения того, какой стандарт анализа использовался при сообщении результатов анализа белка.

Для каждого из представленных здесь анализов белков было проанализировано 14 белков с использованием стандартного протокола пробирки. Было рассчитано чистое (скорректированное на холостое значение) среднее поглощение для каждого белка. Чистое поглощение для каждого белка выражается как отношение к чистому поглощению для BSA (например, отношение 0,80 означает, что белок дает 80% цвета, полученного для эквивалентной массы BSA).Все концентрации белка составляли 1000 мкг / мл, за исключением анализа Micro BCA, концентрация которого составляла 10 мкг / молоко.

Таблица 2. Обзор протеиновых анализов.

66 0,27

Среднее соотношение

6-9 9

131066 1,18 Яичный альбумин

Результаты BCA
(Примечание 1)
Micro
BCA
Модифицированный
Lowry
Coomassie

плюс 908
Pierce
660 нм
Относительная однородность Высокая Высокая Высокая Средняя Низкая (Примечание 2) Низкая
Коэффициент вариации 14.7% 11,4% 11,9% 28,8% 38,2% 37%
Стандартное отклонение 0,15 0,12 0,13 0,21 0,26 1,02 1,05 1,09 0,73 0,68 0,74
Протестированные белки
1. Альбумин, бычья сыворотка 1.00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
2. Альдолаза, мышца кролика 0,85 0,80 0,94 0,74 0,76

66 0,83 альфа-химотрипсиноген

1,14 0,99 1,17 0,52 0,48
4. Цитохром С, сердце лошади 0,83 1.11 0,94 1,03 1,07 1,22
5. Гамма-глобулин, бычий 1,11 0,95 1,14 0,58 0,56 0,51

36

1,21 1,12 1,29 0,63 0,58
7. IgG, человеческий 1,09 1,03 1,13 0,66 0.63 0,57
8. IgG, мышь 1,18 1,23 1,20 0,62 0,59 0,48
9. IgG, кролик 1,12 1,12 0,43 0,37 0,38
10. IgG, овцы 1,17 1,14 1,28 0,57 0,53
11. Инсулин, поджелудочная железа КРС. 08 1,22 1,12 0,67 0,60 0,81
12. Миоглобин, сердце лошади 0,74 0,92 0,90 1,15 1,19 0,93 1,08 1,02 0,68 0,32 0,54
14. Трансферрин, человеческий 0,89 0,98 0.92 0,90 0,84 0,8
15. Альфа-лактальбумин 0,82
36 16. Лизоцим 0,79
17. Ингибитор трипсина, соя 0,38
Вариация от белка к белку анализов Thermo Scientific Pierce Protein Assays Примечания:
1.Анализ совместимости с восстанавливающими агентами (BCA-RAC) также показал низкий коэффициент вариации.
2. Анализ протеинов Bio-Rad Bradford, протестированный с теми же белками, что и наш анализ Кумасси (Брэдфорд), показал очень высокий коэффициент вариации (46%), соответствующий очень низкой относительной однородности.

Расчеты и анализ данных

В большинстве анализов белка концентрации белка в образце определяются путем сравнения их результатов анализа с ответами на серию разведений стандартов, концентрации которых известны.Образцы белка и стандарты обрабатываются таким же образом, смешивая их с реагентом для анализа и используя спектрофотометр для измерения оптической плотности. Отклики стандартов используются для построения или расчета стандартной кривой. Затем значения абсорбции неизвестных образцов интерполируются на график или формулу для стандартной кривой для определения их концентраций.

Очевидно, что наиболее точные результаты возможны только тогда, когда неизвестные и стандартные образцы обрабатываются одинаково.Это включает их анализ в одно и то же время и в одних и тех же буферных условиях, если это возможно. Поскольку задействованы различные этапы дозирования, повторения необходимы, если кто-то хочет рассчитать статистику (например, стандартное отклонение, коэффициент вариации) для учета случайной ошибки.

Рис. 3. Сравнение стандартных кривых для двухточечной и линейной аппроксимации. Интерполяция и расчет для исследуемого образца, имеющего оптическую плотность 0,6, приводят к значительно разным значениям концентрации белка.В этом случае метод «точка-точка» явно обеспечивает более точную контрольную линию для расчета тестового образца.

Хотя большинство современных спектрофотометров и планшет-ридеров имеют встроенное программное обеспечение для анализа данных анализа белков, технические специалисты часто неправильно понимают некоторые факторы. Потратив несколько минут на изучение и правильное применение принципов, задействованных в этих расчетах, можно значительно расширить возможности разработки анализов, дающих наиболее точные результаты (см. Соответствующие технические советы и ссылки).

Количественный анализ пептидов

Для рабочих процессов, использующих протеомику с использованием масс-спектрометрии, важно измерять концентрацию пептидов после этапов расщепления, обогащения и / или очистки C18, чтобы нормализовать вариации от образца к образцу. В частности, для экспериментов, использующих изобарическое мечение, очень важно гарантировать, что равные количества образца помечены перед смешиванием, чтобы получить точные результаты.

Подобно методам анализа белков, доступны различные варианты определения концентрации пептидов.Исторически для измерения концентраций пептидов применялись методы анализа белков в УФ-видимой области (A280) или колориметрические реагенты. Часто используются анализы BCA и микро-BCA. Хотя эти стратегии хорошо работают с образцами белков, эти реагенты не предназначены для точного определения пептидов. Альтернативно, количественные анализы пептидов — в колориметрическом или флуорометрическом формате — доступны для специфического количественного определения смесей пептидов. При выборе формата колориметрического или флуорометрического анализа на микропланшете для количественного анализа пептидов необходимо учитывать следующие важные критерии:

  • Совместимость с типом образца, компонентами и рабочими процессами
  • Диапазон анализа и требуемый объем образца
  • Скорость и удобство для количество образцов для тестирования
  • Наличие спектрофотометра или флуорометра, необходимого для измерения результатов анализа

Эти репрезентативные данные сравнивают результаты, полученные с помощью колориметрических и флуорометрических анализов.

Рис. 4. Количественное сравнение колориметрического и флуориметрического анализа пептидов. Триптические пептидные гидролизаты получали из двенадцати клеточных линий. Концентрации перевариваемых пептидов определяли с использованием количественного колориметрического анализа пептидов Thermo Scientific Pierce и наборов для количественного флуориметрического анализа пептидов Pierce в соответствии с инструкциями. Каждый образец анализировали в трех экземплярах, и концентрацию каждого гидролизата рассчитывали по стандартной кривой, построенной с использованием стандарта анализа протеинового переваривания.


Рекомендуемая литература

  1. Брэдфорд, ММ. (1976) Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах, использующий принцип связывания белок-краситель. Аналитическая биохимия. 72, 248-254.
  2. Смит П.К., Крон Р.И., Хермансон Г.Т. и др. (1987) Измерение белка с использованием бицинхониновой кислоты. Аналитическая биохимия. 150, 76-85.
  3. Крон, Р.И. (2002). Колориметрическое определение и количественное определение общего белка, Current Protocols in Cell Biology, A.3H.1-A.3H.28, John Wiley & Sons, Inc.
  4. Krohn, R.I. (2001). Колориметрическое определение общего белка, Текущие протоколы аналитической химии пищевых продуктов, B1.1.1-B1.1.27, John Wiley & Sons, Inc.
  5. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., et al. (1951) Измерение белка с помощью реагента фолин-фенол. Журнал биологической химии. 193, 265-75.
  6. Legler G, Müller-Platz CM, Mentges-Hettkamp M, et al. (1985) На химической основе определения белка Лоури.Аналитическая биохимия. 150, 278-87.

Статьи по Теме

Обзор методов анализа белков | Thermo Fisher Scientific

Количественное определение концентрации белка является неотъемлемой частью любого лабораторного рабочего процесса, включающего экстракцию, очистку, маркировку или анализ белка. Тесты Pierce Protein Assays предоставляют широкий спектр возможностей для точного определения концентрации белка на основе времени анализа, чувствительности, совместимости, линейности стандартной кривой и вариации от белка к белку.Хотя в этой статье в качестве примеров используются продукты Pierce Protein Assay, обсуждаемые принципы и химический состав в целом применимы к большинству доступных колориметрических или флуорометрических методов анализа белка.

Вступление

Количественное определение белка часто необходимо перед обработкой образцов белка для выделения, разделения и анализа с помощью хроматографических, электрофоретических и иммунохимических методов. В зависимости от требуемой точности, количества и чистоты доступного белка для определения концентрации белка подходят разные методы.

Самый простой и самый прямой метод определения концентрации белка в растворе — это измерение оптической плотности при 280 нм (УФ-диапазон). Аминокислоты, содержащие ароматические боковые цепи (т. Е. Тирозин, триптофан и фенилаланин), обладают сильным поглощением УФ-света. Белки и пептиды поглощают УФ-свет пропорционально содержанию в них ароматических аминокислот и общей концентрации. Другой метод, традиционно используемый в аминокислотном анализе с помощью ВЭЖХ, заключается в маркировке всех первичных аминов (т.е.е., N-конец и боковая цепь остатков лизина) с цветным или флуоресцентным красителем, таким как нингидрин или о-фталевый альдегид (OPA). Подходы с прямым поглощением УФ-света и реагентами для ВЭЖХ имеют особые недостатки, которые делают эти методы непрактичными для использования с типичными образцами белков в рабочих процессах протеомики. Метод УФ-поглощения не идеален для белковых смесей, поскольку разные белки имеют разное содержание ароматических аминокислот, что приводит к разным характеристикам поглощения. Кроме того, любое небелковое вещество, поглощающее УФ-свет, будет мешать измерениям.

Для преодоления этих недостатков было разработано несколько колориметрических и флуоресцентных методик анализа белков на основе реагентов, которые используются почти в каждой лаборатории, занимающейся исследованиями белков. К реагенту добавляют образцы белка, вызывая изменение цвета или усиление флуоресценции пропорционально добавленному количеству. Концентрацию белка определяют по стандартной кривой, состоящей из известных концентраций очищенного эталонного белка. Эти методы анализа белка можно разделить на две группы в зависимости от типа химии.

Таблица 1. Типы, преимущества, недостатки и примеры методов определения белка.

Метод Преимущества Недостатки Пример реагентов для анализа
Поглощение УФ-излучения
  • Простой, не требует каких-либо реагентов для анализа
  • 45847
    с белком смеси или сложные образцы (например, клеточные лизаты)
Биуретовые методы: Хелатирование белка и меди и вторичное обнаружение восстановленной меди
  • Совместимость с большинством поверхностно-активных веществ (детергентов)
  • Кривая линейного отклика (R2 > 0.95)
  • Меньшая вариабельность белок-белок по сравнению с анализами на основе красителя Кумасси
  • Несовместимость с веществами, снижающими медь
  • Несовместимость с обычными восстанавливающими агентами, такими как DTT
Анализ BCA
Анализ Лоури 18
Методы на основе колориметрических красителей: Связывание белков с красителями и прямое определение изменения цвета
  • Быстро и легко выполнять
  • Выполняется при комнатной температуре
  • Совместим с большинством солей, растворителей, буферов, тиолов, восстанавливающих веществ, и металл-хелатирующие агенты
  • Несовместимость с поверхностно-активными веществами (детергентами)
  • Высокая вариабельность белок-белок по сравнению с анализами на основе меди
Bradford (Coomassie)
Методы флуоресцентных красителей: -связывание красителя и прямое обнаружение увеличения флуоресценции как связан со связанным красителем
  • Превосходная чувствительность, требуется меньше образца белка для количественного определения
  • Время не является критическим фактором, поэтому анализы могут быть адаптированы для автоматизированной обработки в высокопроизводительных приложениях
  • Требуется специализированное оборудование
флуоресцентный анализ EZQ
Qubit Protein Assay

Выбор анализа белка

Ни один реагент не может считаться идеальным или лучшим методом анализа белка.У каждого метода есть свои преимущества и недостатки. Выбор среди доступных анализов белка обычно основан на совместимости метода анализа белка с образцами. Кроме того, необходимо учитывать потенциальные мешающие вещества, включенные в образцы, которые могут повлиять на определенные методы анализа, а также на точность, воспроизводимость и желаемое время инкубации. Следовательно, успешное использование анализов белка включает выбор метода, который наиболее совместим с анализируемыми образцами, выбор подходящего стандарта анализа, а также понимание и контроль конкретных допущений и ограничений, которые остаются.

Цель состоит в том, чтобы выбрать метод, который требует минимальных манипуляций или предварительной обработки образцов для размещения веществ, которые мешают анализу. У каждого метода есть свои преимущества и недостатки. Поскольку ни один реагент не может считаться идеальным или лучшим методом анализа белка при любых обстоятельствах, большинство исследователей имеют в своих лабораториях более одного типа анализа белка.

Важные критерии для выбора анализа включают:
  • Совместимость с типом образца и компонентами
  • Диапазон анализа и требуемый объем образца
  • Однородность белка к белку (см. Ниже)
  • Скорость и удобство для количества образцов подлежит тестированию
  • Наличие спектрофотометра или планшет-ридера, необходимого для измерения цвета (оптической плотности) при анализе

Некоторые распространенные вещества, которые потенциально мешают методам анализа белка, являются восстанавливающими агентами (например,я. DTT) и моющие средства (например, Triton X-100). Как правило, образцы, содержащие восстанавливающие агенты или хелатирующие медь агенты, предпочтительно анализируются с помощью анализов на основе красителя Кумасси (метод Брэдфорда). Это связано с тем, что анализы на основе красителя Кумасси, такие как анализы Пирса Кумасси (Брэдфорд) и Пирса Кумасси Плюс (Брэдфорд), совместимы с восстанавливающими агентами и не требуют реакций связывания медь-белок. Для тех образцов, которые содержат детергенты, лучше всего подходят анализы белков на основе меди, такие как анализ BCA Pierce Rapid Gold, поскольку они не ингибируются малыми или умеренными количествами детергента.

Помимо совместимости образцов, анализы белка также обычно группируются по диапазону концентраций белка, которые они могут обнаружить. Для образцов, в которых ожидается низкая концентрация белка (<20 мкг / мл), может потребоваться использование альтернативного протокола анализа на микропланшете или специализированного анализа, такого как анализ белка Pierce Micro BCA, который специально разработан для разбавленные образцы. Если общая концентрация белка в образцах высока (> 2000 мкг / мл), часто можно использовать разбавление образца для решения любых проблем, связанных с известными мешающими веществами.Иногда образец содержит вещества, которые делают его несовместимым с любым из методов анализа белка. Предпочтительный метод борьбы с этими типами мешающих веществ — просто удалить их.

Анализ белков BCA Pierce Rapid Gold и анализ белка Кумасси (Брэдфорд) дополняют друг друга и обеспечивают два основных метода анализа большинства образцов. Различные дополнительные реагенты и альтернативные версии этих двух анализов позволяют удовлетворить многие другие потребности в образцах.


Выбор стандарта белка

Поскольку белки различаются по своему аминокислотному составу, каждый из них по-разному реагирует на каждый тип анализа белка. Следовательно, лучший выбор для эталонного стандарта — это очищенная, известная концентрация белка, наиболее распространенного в образцах. Обычно этого невозможно достичь, и это редко бывает удобно или необходимо. Во многих случаях цель состоит в том, чтобы просто оценить общую концентрацию белка, и небольшая вариабельность между белками является допустимой.

Если высокоочищенная версия интересующего белка недоступна или слишком дорога для использования в качестве стандарта, альтернативой является выбор белка, который будет давать очень похожую кривую цветового отклика в выбранном методе анализа белка и легко доступны для любой лаборатории в любое время. Как правило, бычий сывороточный альбумин (БСА) хорошо подходит для стандарта белка, поскольку он широко доступен в высокой чистоте и относительно недорого. В качестве альтернативы, бычий гамма-глобулин (BGG) является хорошим стандартом при определении концентрации антител, поскольку BGG дает кривую цветового ответа, которая очень похожа на кривую иммуноглобулина G (IgG).

Для максимальной точности оценки общей концентрации белка в неизвестных образцах важно включать стандартную кривую каждый раз при проведении анализа. Это особенно верно для методов анализа белка, которые дают нелинейные стандартные кривые. Выбор количества стандартов и повторов, используемых для определения стандартной кривой, зависит от степени нелинейности стандартной кривой и требуемой степени точности. Как правило, для построения стандартной кривой требуется меньше точек, если цветовая характеристика линейна.Обычно стандартные кривые строятся с использованием как минимум двух повторов для каждой точки кривой.


Подготовка проб для анализа белка

Перед анализом образца на общее содержание белка его необходимо растворить, обычно в забуференном водном растворе. Часто принимаются дополнительные меры предосторожности, чтобы подавить рост микробов или избежать случайного загрязнения образца посторонними предметами, такими как пыль, волосы, кожные или телесные масла.

В зависимости от исходного материала, который используется в процедурах перед проведением анализа белка, образец будет содержать множество небелковых компонентов.Знание этих компонентов имеет решающее значение для выбора подходящего метода анализа и оценки причины аномальных результатов. Например, ткани и клетки обычно лизируются буферами, содержащими поверхностно-активные вещества (детергенты), биоциды (антимикробные агенты) и ингибиторы протеаз. Также могут быть включены различные соли, денатурирующие агенты, восстанавливающие агенты и хаотропы. После фильтрации или центрифугирования для удаления клеточного мусора типичные образцы по-прежнему будут включать нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые соединения.

На каждый тип анализа белка неблагоприятно влияют вещества того или иного вида. Компоненты белкового раствора считаются мешающими веществами в анализе белка, если они искусственно подавляют ответ, усиливают ответ или вызывают повышенный фон на произвольно выбранную степень (например, на 10% по сравнению с контролем).

Неточность из-за небольшого количества мешающего вещества может быть устранена путем приготовления стандарта белка в том же буфере, что и анализируемый белок.Для более высоких, несовместимых уровней мешающих веществ необходимы другие стратегии:

  • Выберите другой метод анализа белка или версию того же метода анализа, которая включает компоненты для преодоления помех.
  • Диализ или обессоливание пробы для удаления мелких мешающих веществ (т.е. менее 1000 дальтон), таких как восстановители.
  • Осаждение белка в TCA или другом подходящем реагенте, удаление раствора, содержащего мешающий компонент, и затем повторное растворение белка для анализа.На этой иллюстрации представлен обзор того, как методы диализа белка используются для удаления веществ, которые могут загрязнять образцы белка и мешать последующим применениям.

Рис. 1. На схеме показано, как диализную кассету можно использовать для очистки белка. 3 мл 1 мг / мл IgG в 0,1 М трис-буфере, pH 7, внутри диализной кассеты помещают в 1000 мл 100 мМ PBS с pH 7,6. Старый диализат удаляют и заменяют 1000 мл 100 мМ PBS с pH 7.6. IgG слишком велик для проникновения в поры мембраны; следовательно, количество IgG внутри кассеты остается постоянным. Концентрация Трис-буфера внутри кассеты падает ниже 0,01 М по мере диффузии Трис-буфера и диффузии буфера PBS. Опять же, старый диализат отбрасывается и заменяется 1000 мл 100 мМ PBS с pH 7,6. IgG внутри кассеты остается постоянным. Уровень трис-буфера внутри кассеты падает почти до неопределяемого уровня. Буфер внутри кассеты представляет собой 100 мМ PBS с pH 7.6.


Различия между белками

Каждый белок в образце отвечает уникальным образом в данном анализе белка. Такое изменение от белка к белку относится к различиям в степени окраски (оптической плотности), получаемой при одновременном анализе одной и той же массы различных белков одним и тем же методом. Эти различия в цветовой реакции связаны с различиями в аминокислотной последовательности, изоэлектрической точке (pI), вторичной структуре и присутствием определенных боковых цепей или простетических групп.

В зависимости от типа образца и цели проведения анализа, вариация от белка к белку является важным фактором при выборе метода анализа белка и при выборе подходящего стандарта анализа (например, BSA по сравнению с BGG). Методы анализа белков, основанные на аналогичном химическом составе, имеют схожие вариации от белка к белку.

Рисунок 2. Стандартные кривые. Примеры стандартных кривых с использованием очищенного BSA и BGG с набором для анализа белков Pierce BCA Protein Assay Kit, иллюстрирующие различия в интенсивности окраски двух разных белков.


Вариация белково-белковых анализов на белок

Протеиновые анализы различаются по своей химической основе для обнаружения специфичных для белков функциональных групп. Некоторые методы анализа обнаруживают пептидные связи, но ни один анализ не делает этого исключительно. Вместо этого каждый анализ белка обнаруживает одну или несколько различных конкретных аминокислот с большей чувствительностью, чем другие. Следовательно, белки с различным аминокислотным составом дают окраску с разной скоростью или интенсивностью в любом данном анализе белка.

В следующей таблице сравнивается вариабельность цветового ответа от белка к белку в нескольких анализах протеина Thermo Scientific Pierce. Эти данные служат в качестве общего руководства для оценки различий в ответах между образцами белка. Однако, поскольку сравнения проводились с использованием одной концентрации белка и буфера, их не следует использовать в качестве точных калибровочных коэффициентов.

Эта информация о вариабельности полезна при выборе стандарта белка. Например, когда анализируемый образец представляет собой очищенное антитело, бычий гамма-глобулин (BGG, белок № 5) будет более точным стандартом, чем бычий сывороточный альбумин (BSA, белок № 1).Эти данные также указывают на важность определения того, какой стандарт анализа использовался при сообщении результатов анализа белка.

Для каждого из представленных здесь анализов белков было проанализировано 14 белков с использованием стандартного протокола пробирки. Было рассчитано чистое (скорректированное на холостое значение) среднее поглощение для каждого белка. Чистое поглощение для каждого белка выражается как отношение к чистому поглощению для BSA (например, отношение 0,80 означает, что белок дает 80% цвета, полученного для эквивалентной массы BSA).Все концентрации белка составляли 1000 мкг / мл, за исключением анализа Micro BCA, концентрация которого составляла 10 мкг / молоко.

Таблица 2. Обзор протеиновых анализов.

66 0,27

Среднее соотношение

6-9 9

131066 1,18 Яичный альбумин

Результаты BCA
(Примечание 1)
Micro
BCA
Модифицированный
Lowry
Coomassie

плюс 908
Pierce
660 нм
Относительная однородность Высокая Высокая Высокая Средняя Низкая (Примечание 2) Низкая
Коэффициент вариации 14.7% 11,4% 11,9% 28,8% 38,2% 37%
Стандартное отклонение 0,15 0,12 0,13 0,21 0,26 1,02 1,05 1,09 0,73 0,68 0,74
Протестированные белки
1. Альбумин, бычья сыворотка 1.00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
2. Альдолаза, мышца кролика 0,85 0,80 0,94 0,74 0,76

66 0,83 альфа-химотрипсиноген

1,14 0,99 1,17 0,52 0,48
4. Цитохром С, сердце лошади 0,83 1.11 0,94 1,03 1,07 1,22
5. Гамма-глобулин, бычий 1,11 0,95 1,14 0,58 0,56 0,51

36

1,21 1,12 1,29 0,63 0,58
7. IgG, человеческий 1,09 1,03 1,13 0,66 0.63 0,57
8. IgG, мышь 1,18 1,23 1,20 0,62 0,59 0,48
9. IgG, кролик 1,12 1,12 0,43 0,37 0,38
10. IgG, овцы 1,17 1,14 1,28 0,57 0,53
11. Инсулин, поджелудочная железа КРС. 08 1,22 1,12 0,67 0,60 0,81
12. Миоглобин, сердце лошади 0,74 0,92 0,90 1,15 1,19 0,93 1,08 1,02 0,68 0,32 0,54
14. Трансферрин, человеческий 0,89 0,98 0.92 0,90 0,84 0,8
15. Альфа-лактальбумин 0,82
36 16. Лизоцим 0,79
17. Ингибитор трипсина, соя 0,38
Вариация от белка к белку анализов Thermo Scientific Pierce Protein Assays Примечания:
1.Анализ совместимости с восстанавливающими агентами (BCA-RAC) также показал низкий коэффициент вариации.
2. Анализ протеинов Bio-Rad Bradford, протестированный с теми же белками, что и наш анализ Кумасси (Брэдфорд), показал очень высокий коэффициент вариации (46%), соответствующий очень низкой относительной однородности.

Расчеты и анализ данных

В большинстве анализов белка концентрации белка в образце определяются путем сравнения их результатов анализа с ответами на серию разведений стандартов, концентрации которых известны.Образцы белка и стандарты обрабатываются таким же образом, смешивая их с реагентом для анализа и используя спектрофотометр для измерения оптической плотности. Отклики стандартов используются для построения или расчета стандартной кривой. Затем значения абсорбции неизвестных образцов интерполируются на график или формулу для стандартной кривой для определения их концентраций.

Очевидно, что наиболее точные результаты возможны только тогда, когда неизвестные и стандартные образцы обрабатываются одинаково.Это включает их анализ в одно и то же время и в одних и тех же буферных условиях, если это возможно. Поскольку задействованы различные этапы дозирования, повторения необходимы, если кто-то хочет рассчитать статистику (например, стандартное отклонение, коэффициент вариации) для учета случайной ошибки.

Рис. 3. Сравнение стандартных кривых для двухточечной и линейной аппроксимации. Интерполяция и расчет для исследуемого образца, имеющего оптическую плотность 0,6, приводят к значительно разным значениям концентрации белка.В этом случае метод «точка-точка» явно обеспечивает более точную контрольную линию для расчета тестового образца.

Хотя большинство современных спектрофотометров и планшет-ридеров имеют встроенное программное обеспечение для анализа данных анализа белков, технические специалисты часто неправильно понимают некоторые факторы. Потратив несколько минут на изучение и правильное применение принципов, задействованных в этих расчетах, можно значительно расширить возможности разработки анализов, дающих наиболее точные результаты (см. Соответствующие технические советы и ссылки).

Количественный анализ пептидов

Для рабочих процессов, использующих протеомику с использованием масс-спектрометрии, важно измерять концентрацию пептидов после этапов расщепления, обогащения и / или очистки C18, чтобы нормализовать вариации от образца к образцу. В частности, для экспериментов, использующих изобарическое мечение, очень важно гарантировать, что равные количества образца помечены перед смешиванием, чтобы получить точные результаты.

Подобно методам анализа белков, доступны различные варианты определения концентрации пептидов.Исторически для измерения концентраций пептидов применялись методы анализа белков в УФ-видимой области (A280) или колориметрические реагенты. Часто используются анализы BCA и микро-BCA. Хотя эти стратегии хорошо работают с образцами белков, эти реагенты не предназначены для точного определения пептидов. Альтернативно, количественные анализы пептидов — в колориметрическом или флуорометрическом формате — доступны для специфического количественного определения смесей пептидов. При выборе формата колориметрического или флуорометрического анализа на микропланшете для количественного анализа пептидов необходимо учитывать следующие важные критерии:

  • Совместимость с типом образца, компонентами и рабочими процессами
  • Диапазон анализа и требуемый объем образца
  • Скорость и удобство для количество образцов для тестирования
  • Наличие спектрофотометра или флуорометра, необходимого для измерения результатов анализа

Эти репрезентативные данные сравнивают результаты, полученные с помощью колориметрических и флуорометрических анализов.

Рис. 4. Количественное сравнение колориметрического и флуориметрического анализа пептидов. Триптические пептидные гидролизаты получали из двенадцати клеточных линий. Концентрации перевариваемых пептидов определяли с использованием количественного колориметрического анализа пептидов Thermo Scientific Pierce и наборов для количественного флуориметрического анализа пептидов Pierce в соответствии с инструкциями. Каждый образец анализировали в трех экземплярах, и концентрацию каждого гидролизата рассчитывали по стандартной кривой, построенной с использованием стандарта анализа протеинового переваривания.


Рекомендуемая литература

  1. Брэдфорд, ММ. (1976) Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах, использующий принцип связывания белок-краситель. Аналитическая биохимия. 72, 248-254.
  2. Смит П.К., Крон Р.И., Хермансон Г.Т. и др. (1987) Измерение белка с использованием бицинхониновой кислоты. Аналитическая биохимия. 150, 76-85.
  3. Крон, Р.И. (2002). Колориметрическое определение и количественное определение общего белка, Current Protocols in Cell Biology, A.3H.1-A.3H.28, John Wiley & Sons, Inc.
  4. Krohn, R.I. (2001). Колориметрическое определение общего белка, Текущие протоколы аналитической химии пищевых продуктов, B1.1.1-B1.1.27, John Wiley & Sons, Inc.
  5. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., et al. (1951) Измерение белка с помощью реагента фолин-фенол. Журнал биологической химии. 193, 265-75.
  6. Legler G, Müller-Platz CM, Mentges-Hettkamp M, et al. (1985) На химической основе определения белка Лоури.Аналитическая биохимия. 150, 278-87.

Статьи по Теме

Определение белка — обзор

Гиперкальциемия и злокачественная опухоль

Анализ PTHrP чаще всего используется для установления патогенеза у пациента с гиперкальциемией, обычно с раком (91,92). В целом, у большинства пациентов с гиперкальциемией и солидными опухолями уровень PTHrP в сыворотке повышен независимо от типа опухоли (85–92). Эта картина возникла в результате ранних исследований, которые предположили, что плоскоклеточные опухоли с большей вероятностью связаны с повышенными уровнями PTHrP в сыворотке (89, 90).Напротив, у большинства пациентов со злокачественными новообразованиями и нормальным уровнем кальция не наблюдается повышенного уровня PTHrP в сыворотке крови (87, 90). Хотя есть исключения из этого общего правила, это справедливо для большинства систем анализа PTHrP (91,92). PTHrP, по-видимому, играет лишь незначительную роль в гематологических злокачественных новообразованиях, за исключением Т-клеточного лейкоза / лимфомы взрослых (91, 140, 141). Хотя существует вариабельность, примерно у половины этих пациентов гиперкальциемия связана с повышенной экспрессией PTHrP раковыми клетками (89, 90, 140, 141).Это контрастирует с миеломой и гиперкальциемией, при которых повышение уровня PTHrP в сыворотке встречается редко, даже если у пациента гиперкальциемия (89, 141). Между прочим, такая же ситуация, кажется, относится к саркоидозу (158). В отличие от продукции PTHrP при раке, сейчас известно, что экспрессия PTH при злокачественных новообразованиях настолько редка, что о ней можно сообщить (89,91,159–166). Фактически, повышенный уровень паратгормона в сыворотке у пациента со злокачественными новообразованиями (при отсутствии почечной недостаточности и вторичного гиперпаратиреоза), скорее всего, отражает сосуществующий PHPT.

Несколько исследований PTHrP и гиперкальциемии также оценивали наличие или отсутствие метастазов в скелете (89,97,126,156). В общем, между этими клиническими событиями может быть разобщенность. Таким образом, многие опухоли, продуцирующие PTHrP, способствуют развитию гиперкальциемии независимо от наличия или отсутствия метастазов в скелете (89,100). Таким образом, PTHrP может действовать как «юмор» при гиперкальциемии злокачественной опухоли и стимулировать резорбцию остеокластической кости за счет увеличения циркулирующих уровней, обусловленных экспрессией опухоли (89,92).Конечно, независимо от продукции PTHrP, метастатическая опухоль может иметь такой же эффект, называемый местной остеолитической гиперкальциемией (LOH), чтобы отличить ее от гуморальной гиперкальциемии злокачественной опухоли (160).

Аденомы паращитовидных желез или гиперпластические железы, вторичные по отношению к почечной недостаточности, обычно экспрессируют мРНК PTHrP (167–169). Однако большинство отчетов демонстрируют повышенные уровни циркулирующего PTHrP только при вторичном гиперпаратиреозе, когда накопление фрагментов может способствовать измерению (88, 109, 143).Как и в случае вторичного гиперпаратиреоза почечной недостаточности, карбоксиконцевые фрагменты PTHrP накапливаются больше, чем другие фрагменты (109, 134, 143, 157). Наиболее важная клиническая взаимосвязь между ПТГ и ПТГП — диссоциация между ними, обнаруживаемая при гиперкальциемии и злокачественных новообразованиях, когда ПТГ в сыворотке подавляется, а ПТГП в сыворотке обычно повышается (88).

Методы оценки белка

Определение концентрации белка необходимо и широко используется в биологии белков, молекулярной биологии и других исследовательских приложениях.Перед тем, как приступить к выделению, очистке и анализу, необходимо оценить концентрацию образцов белка. К настоящему времени разработаны различные методы оценки белка. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки перед другими. Большинство этих методов зависят от уровней триптофана, тирозина и других ароматических аминокислот.

Перед выбором метода следует учитывать три основных фактора.

  1. Чувствительность — Метод известен как чувствительный, если он может обнаруживать белок в очень низких концентрациях.
  2. Конкретный — Конкретность метода определяется его эффективностью по обнаружению белка, в частности, от всех других мешающих веществ.
  3. Время — Продолжительность времени для завершения анализа и интерпретации результатов.
Ниже перечислены различные методы оценки концентрации белка:
  • Биуретовый метод: Чувствительность этого метода очень низкая. Требуется высокий уровень протеина из 1-20 мг протеина.Реагентами, используемыми в этом методе, являются сульфат меди, гидроксид натрия и тартрат калия-натрия. Белок вступает в реакцию с этим щелочным комплексом меди и меняет цвет на фиолетовый. Затем белок можно оценить, считывая абсорбцию при 540 нм. Этот метод занимает 20–30 минут. Этот метод не зависит от аминокислотного состава и, следовательно, позволяет точно измерить все образцы белка. Основным недостатком этого метода является то, что буферы с трис-аммиаком мешают реакции.
  • Поглощение УФ: Чувствительность метода средняя. Он может обнаруживать белки в диапазоне 50-100 мкг. В этом методе реагенты не требуются, жидкий образец белка контролируется по УФ-поглощению при OD 280 нм. В последнее время используются простые устройства, такие как Nanodrop и pico drop, где даже 1 мкл образца белка достаточно для определения концентрации белка. Этот метод занимает меньше времени, в пределах 10 минут.
  • Анализ BCA: Этот метод является высокочувствительным и обнаруживает белки при низкой концентрации 1 мкг.В этом методе ионы меди связываются с нитрогенами в белке, а затем комплекс связывается с бицинхониновой кислотой, что приводит к изменению цвета на пурпурный в зависимости от концентрации белка. Этот метод чувствителен к некоторым химическим веществам. Этот метод занимает больше всего времени, чтобы получить конечный результат примерно за час. Обычными мешающими веществами являются липиды, углеводы, железо, примеси из глицерина и т. Д.,
  • Анализ Лоури: Анализ Лоури — один из старых методов, используемых для оценки белка, разработанный Оливером Лоури (1951).Это очень чувствительный метод, который дает точные результаты. Он обнаруживает белки при низких концентрациях 2-5 мкг. В этом методе, во-первых, ионы меди восстанавливаются в щелочных условиях и образуют комплекс с пептидными связями белка. Этот комплекс затем восстанавливает реагент Фолин-Чокалто, что приводит к изменению цвета на темно-синий, а поглощение может быть измерено при 650-750 нм. Для завершения анализа требуется около 45-60 минут. Доступны совместимый анализ Лоури для образцов с восстановителями и другими мешающими агентами и модифицированный анализ Лоури для образцов в детергентах.
  • Анализ Брэдфорда: Этот метод был разработан Мэрион М. Брэдфорд (1976) и широко используется. Это очень чувствительный метод и простой анализ связывания красителя. В этом методе используется краситель Кумасси бриллиантовый синий-250, который связывается с отрицательно заряженными молекулами белка. Цвет красителя изменяется в зависимости от концентрации белка, а поглощение измеряется при 595 нм. Этот метод занимает гораздо меньше времени по сравнению с другими анализами на основе регента. В течение 10-15 минут можно получить результат. Используя стандартную кривую, можно мгновенно оценить концентрацию белка.Основным недостатком этого метода является меньшая специфичность к мешающим веществам, таким как SDS, Triton x-100 и т. Д. Также доступен анализ Брэдфорда с реагентами для очистки образцов перед анализом. В дополнение к красителю Coomassie blue 250, другие красители, такие как Pyrogallol red, Bromocresol green, также используются для оценки белка.

Ссылки:
1. Лоури, Огайо, Роуз Бро, Нью-Джерси, Фарр А.Л., Рэндалл Р.Дж. Измерение белка с помощью реагента фолин-фенол. J Biol Chem. 1951 ноябрь; 193 (1): 265-75
2..Bradford, MM # (1976), Быстрый и чувствительный метод количественного определения
микрограмм белка с использованием принципа связывания белок-краситель », # Anal. Biochem., # 72: 248–254.

(PDF) Метод определения белка имеет значение

Foods 2018,7, 5 10 из 11

Ссылки

1.

Wu, GY; Bazer, FW; Dai, ZL; Li, DF; Wang, JJ; Wu, ZL Аминокислота питание животных: синтез протеина

и не только. Annu. Rev. Anim. Biosci.2014,2, 387–417. [CrossRef] [PubMed]

2.

Вулф Р. Р. Недооцененная роль мышц в здоровье и болезнях. Являюсь. J. Clin. Nutr.

2006

, 84, 475–482.

[PubMed]

3.

Wilson, K .; Уокер, Дж. Принципы и методы практической биохимии; Cambridge University Press:

Cambridge, UK, 2010.

4.

Angell, A.R .; Mata, L .; de Nys, R .; Пол, Н.А. Содержание белка в морских водорослях: универсальный коэффициент преобразования азота в белок

, равный пяти.J. Appl. Phycol. 2016,28, 511–524. [CrossRef]

5. Имафидон, G.I .; Сосульский, Ф.В. Небелковое содержание азота в продуктах животного и растительного происхождения. J. Agric. Food Chem.

1990,38, 114–118. [CrossRef]

6.

Джонс, Д. Б. Факторы для преобразования процентного содержания азота в пище и кормах в процентное содержание белка; US

Министерство сельского хозяйства: Вашингтон, округ Колумбия, США, 1941.

7.

Mariotti, F .; Tome, D .; Миранд, П. Превращение азота в белок — больше 6.25 и факторы Джонса.

Крит. Rev. Food Sci. 2008, 48, 177–184. [CrossRef] [PubMed]

8.

Good, N.E .; Winget, G.D .; Зима, Вт .; Connolly, T.N .; Идзава, S .; Сингх, Р.М.М. Буферы для ионов водорода для

биологических исследований. Биохимия 1966,5, 467–477. [CrossRef] [PubMed]

9.

Maehre, H.K .; Jensen, I.J .; Эйлерцен, К. Ферментативная предварительная обработка увеличивает биодоступность белка и экстрагируемость

в дульсе (Palmaria palmata).Мар. Наркотики 2016, 14, 1–10. [CrossRef] [PubMed]

10.

Alhamdani, M.S.S .; Schröder, C .; Werner, J .; Giese, N .; Bauer, A .; Hoheisel, J.D. Одностадийная процедура выделения белков

в условиях, близких к нативным, из тканей млекопитающих для протеомного анализа на микрочипах антител

. J. Proteome Res. 2010,9, 963–971. [CrossRef] [PubMed]

11.

Maehre, H.K .; Эдвинсен, Г.К .; Eilertsen, K.E .; Эльвеволл, Э. Тепловая обработка увеличивает биодоступность белка

в красных водорослях (Palmaria palmata), но не в коричневых водорослях крылатых водорослей

(Alaria esculenta).J. Appl. Phycol. 2016, 28, 581–590.

12.

Moore, S .; Штейн, W.H. Хроматографическое определение аминокислот с использованием автоматической записывающей аппаратуры

. Метод Энзимол. 1963,6, 819–831.

13.

Maehre, H.K .; Hamre, K .; Эльвеволл, Э. Оценка питательных веществ коловраток и зоопланктона: корм для морских личинок

рыб. Aquacult. Nutr. 2013,19, 301–311. [CrossRef]

14.

Латимер, Г.В. Официальные методы анализа AOAC International; AOAC International: Gaithersburg, MD,

USA, 2016.

15.

Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in Organischen Körpern. Fresenius

J. Anal. Chem.

1883,22, 366–382. [CrossRef]

16.

Lourenço, S.O .; Barbarino, E .; De-Paula, J.C .; Pereira, L.O.d.S .; Ланфер Маркес, У. Состав аминокислот

, содержание белка и расчет коэффициентов преобразования азота в белок для 19 тропических водорослей

. Phycol. Res. 2002,50, 233–241.[CrossRef]

17.

Hartree, E.F. Определение белка — модификация метода Лоури, дающая линейный фотометрический отклик

. Анальный. Biochem. 1972,48, 422–427. [CrossRef]

18.

Bradford, M.M. Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах, использующий принцип связывания белок-краситель

. Анальный. Biochem. 1976,72, 248–254. [CrossRef]

19.

Pickering, M.V .; Ньютон, П. Гидролиз аминокислот — старые проблемы, новые решения.LC GC Mag. Сен.

1990,8, 778–780.

20.

ФАО. Пищевая энергия — методы анализа и коэффициенты пересчета; Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций

United Nations: Rome, Italy, 2003.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *