Глицин препарат инструкция: (Glycine), , , , , , 100 , , 100

Содержание

Глицин — описание ингредиента, инструкция по применению, показания и противопоказания

Описание глицина

Глицин – это нейромедиаторная аминокислота, которая используется в медицине как ноотропное лекарственное средство. Синоним – аминоуксусная кислота. Она присутствует в составе многочисленных белков. Из нее в клетках живых организмов синтезируются производные пурина.

Препараты глицина используются в терапии психических и невролгических заболеваний. В головном и спинном мозге есть глициновые рецепторы. Аминокислота прикрепляется к ним и оказывает «замедляющее» воздействие на нейроны, сокращает выработку из них «возбуждающих» аминокислот и усиливает выделение гамма-аминомасляной кислоты – главного тормозного нейромедиатора. Глицин – это природный антидепрессант и стабилизатор нервной системы.

Состав и форма выпуска глицина

Глицин выпускается в форме таблеток белого цвета.

В состав одного драже входит 100 мг активного вещества, 1 мг стеарата магния и 1 мг метилцеллюлозы.

Фармакологические свойства

Аминоуксусная кислота регулирует обменные процессы, которые активируют и приостанавливают защитное торможение в ЦНС. Препарат помогает поддерживать психическое и эмоциональное состояние в норме. Он снижает напряжение, тревожность и повышает интеллектуальные способности. Помимо этого, глицин:

  • повышает настроение;
  • облегчает засыпание;
  • улучшает качество сна;
  • снижает воздействие угнетающих ЦНС токсинов;
  • снимает стресс;
  • нормализует самочувствие;
  • успокаивает.

Действие на организм

Глицин нормализует деятельность мозга и восстанавливает нормальное функционирование нервной системы. Его можно принимать при наличии следующих состояний и болезней:

  • стрессовые ситуации;
  • ишемический инсульт;
  • неврозы и повышенная возбудимость;
  • вегетососудистая дистония;
  • энцефалопатия;
  • черепно-мозговые травмы.

Противопоказания и побочные эффекты

Относительными противопоказаниями к приему глицина являются беременность, грудное вскармливание.

Воздействие препарата на плод и новорожденного ребенка, находящегося на грудном вскармливании, пока не изучено, поэтому лучше отказаться от его применения.

Внимание! При гипотонии и одновременном приеме глицина нужно регулярно проверять артериальное давление. Если будут выявлены нарушения, следует скорректировать дозировку или заменить препарат на альтернативный.

Способы применения и дозировки

Глицин принимают сублингвально: кладут под язык и ждут полного растворения таблетки. Дозы и частота приема зависят от возраста человека, диагноза и клинической картины. Взрослые обычно употребляют по 1-2 таблетке в день на протяжении 30–90 суток. Затем делается как минимум трехмесячный перерыв, после чего можно возобновлять терапию.

Детям препарат разрешен с 3 лет. Суточная доза не должна превышать 50% таблетки. Пьют это количество средства трижды в день не дольше 2 недель. По достижении ребенком 7 лет можно повысить дозу до целой таблетки или даже двух.

Внимание! Прием глицина во время беременности или лактации нужно осуществлять под контролем врача.

Отказ от ответсвенности

Обращаем ваше внимание, что вся информация, размещённая на сайте Prowellness предоставлена исключительно в ознакомительных целях и не является персональной программой, прямой рекомендацией к действию или врачебными советами. Не используйте данные материалы для диагностики, лечения или проведения любых медицинских манипуляций. Перед применением любой методики или употреблением любого продукта проконсультируйтесь с врачом. Данный сайт не является специализированным медицинским порталом и не заменяет профессиональной консультации специалиста.

Владелец Сайта не несет никакой ответственности ни перед какой стороной, понесший косвенный или прямой ущерб в результате неправильного использования материалов, размещенных на данном ресурсе.

инструкция, отзывы, цена в Аптеке НЦ

Состав
действующее вещество: Glycine;
1 таблетка Сублингвальная содержит глицина 100 мг
вспомогательные вещества:, воск горный гликолевый, аммонийно-метакрилатный сополимер (тип А), кальция стеарат.

Лекарственная форма. Таблетки сублингвальные.
Основные физико-химические свойства: таблетки белого цвета с фаской и риской.

Фармакологическая группа. Средства, действующие на нервную систему.
Код АТХ N07X X.

Фармакологические свойства.
Фармакологические.
Глицин относится к заменимым аминокислотам. Глицин легко проникает в биологических жидкостей и тканей организма, в т. Ч. Головной мозг, метаболизируется; накопление его в тканях не происходит. Быстро разрушается в печени глициноксидазой до воды и углекислого газа.
Фармококинетика.
Глицин является центральным нейромедиатором, который регулирует обмен веществ нормализует и активирует процессы защитного торможения в центральной нервной системе. Улучшает метаболические процессы в тканях мозга, оказывает антидепрессивное и седативное действие. Оказывает глицин и ГАМК-эргическую, альфа1- адреноблокирующее, антиоксидантное, антитоксическое действие; регулирует деятельность глутаматных (NMDA) рецепторов, за счет чего уменьшает психоэмоциональное напряжение, агрессивность и конфликтность; повышает социальную адаптацию, улучшает настроение; облегчает засыпание и нормализует сон, повышает умственную работоспособность, уменьшает выраженность вегетососудистой нарушений.
L-глицин (гликакол) участвует в синтезе важнейших для организма веществ: нуклеиновых кислот, глутатиона, желчных кислот и тому подобное. Глицин используется в синтезе порфирина — предшественника гема в молекуле гемоглобина, а также пуриновых оснований — важнейших элементов нуклеиновых кислот. Глицин входит в структуру глутатионовмисних веществ, играет особую роль в системе антирадиального защиты.
Глицин участвует в реакциях дезинтоксикации, включаясь в состав гиппуровой кислоты, а также в синтезе желчных кислот (гликохолева кислота). Кроме того, глицин имеет важное значение для процессов биосинтеза щавелевой кислоты.

Клинические характеристики.
Показания.
Снижение умственной работоспособности. При стрессовых ситуациях и психоэмоциональном напряжении (в период экзаменов, при конфликтных ситуациях). Девиантные формы поведения детей и взрослых.
Функциональные и органические заболевания нервной системы (неврозы, неврозоподобные состояния, вегето-сосудистые дистонии, последствиях нейроинфекции и черепно-мозговой травмы, перинатальные и другие формы энцефалопатии, в том числе алкогольного генеза), которые сопровождаются повышенной возбудимостью, эмоциональной нестабильностью, снижением умственной работоспособности, нарушением сна.
Ишемический инсульт и нарушения мозгового кровообращения.
Как вспомогательное средство при лечении алкоголизма.

Противопоказания.
Индивидуальная непереносимость препарата и повышенная чувствительность к отдельным его компонентов; артериальная гипотензия. Возраст до 3 лет.

Особые меры безопасности.
Пациентам со склонностью к артериальной гипотензии необходимо контролировать уровень артериального давления и при необходимости проводить коррекцию дозы препарата: Глицин назначают в меньших дозах и при условии регулярного контроля артериального давления. При показателях артериального давления ниже обычного уровня прием препарата прекращают.

Взаимодействие с другими лекарственными средствами и другие виды взаимодействий.
Глицин снижает токсичность антиконвульсантов, антипсихотических средств, антидепрессантов, против- судорожных средств. При сочетании со снотворными, транквилизаторами и антипсихотическими средствами усиливается эффект торможения центральной нервной системы.

Особенности применения.

Применение в период беременности или кормления грудью.
Влияние Глицина на организм в период беременности и кормления грудью подробно исследовался, поэтому применение препарата не рекомендуется.

Способность влиять на скорость реакции при управлении автотранспортом или другими механизмами.
Необходимо соблюдать осторожность при управлении автотранспортом или работе с другими механизмами, а также занятии потенциально опасными видами деятельности.

Способ применения и дозы.
Глицин применяется трансбукально или сублингвально (в таблетках в виде порошка после измельчения таблетки).
Детям в возрасте от 3 лет, подросткам, взрослым при снижении умственной работоспособности, памяти, внимания, при задержке умственного развития, при психоэмоциональном напряжении, при девиантных формах поведения Глицин назначают по 1 таблетке (100 мг) 2-3 раза в сутки в течение 14 -30 дней.
Максимальная суточная доза 300 мг.
Детям в возрасте от 3 лет и взрослым при функциональных и органических заболеваниях нервной системы (неврозы, неврозоподобные состояния, вегето-сосудистые дистонии, последствиях нейроинфекции и черепно-мозговой травмы, перинатальные и другие формы энцефалопатии) назначают по 1 таблетке 2 — 3 раза в сутки, курс лечения — 7 — 14 дней. При необходимости курс лечения повторяют.
При нарушениях сна назначают по 50 — 100 мг за 20 мин до сна или непосредственно перед сном.

При ишемическом мозговом инсульте и нарушениях мозгового кровообращения назначают 1 г препарата трансбукально или сублингвально (при необходимости таблетку растереть) в течение первых 3 — 6 часов от развития инсульта, далее — в течение 1 — 5 суток — по 1 г в сутки, затем — в течение 6 — 30 суток — по 1 — 2 таблетки 3 раза в сутки.
При лечении алкоголизма назначают как вспомогательное средство по 1 таблетке 2 — 3 раза в сутки в течение 14 — 30 дней. При необходимости курс лечения повторяют 4 — 6 раз в год.

Дети.
Препарат применяют детям в возрасте от 3 лет.

Передозировки.
О клинических проявлениях передозировки сведений нет.

Побочные реакции.
В отдельных случаях при индивидуальной повышенной чувствительности возможно развитие аллергических реакций, а именно: ринит, конъюнктивит, крапивница, раздражение в горле, слабость.

Срок годности.
3 года. Не применять после истечения срока годности.

Условия хранения.
Хранить в оригинальной упаковке в недоступном для детей месте при температуре не выше 25 ° С.

Упаковка.
По 50 таблеток сублингвальный в блистере. По 1 блистера в картонной коробке.

Категория отпуска.
Без рецепта.

Производитель.
ООО «Арпимед».

инструкция по применению, отзывы, действие и дозировка

Ни один всдшник не прошел мимо этого недорогого и доступного ноотропного препарата. Конечно же я имею ввиду Глицин – любимое лекарство неврологов, кардиологов и терапевтов. Хотя на самом деле чудодейственные свойства глицина разбирают по винтикам скептики, а с другой стороны сторонники лечения глицином приводят неоспоримые доводы его пользы. Давайте попробуем немного разобраться что это за препарат под названием Глицин и как он действует на наш организм.

Глицин по составу – аминокислота, поступает в организм извне. Точка приложения глицина – метаболизм нервной клетки, действие на процессы возбуждения и торможения, их соотношение. Основные действия глицина, те, которые изучены и опытным путем доказаны – ну, хотя бы в процессе 10-летнего применения:
Глицин усиливает процессы охранительного торможения, снижая при этом возбудимость нервной системы и создавая все связанные с этим действием эффекты – облегчение засыпания, улучшения внимания и обучаемости, уменьшает двигательную гиперактивность. Улучшая обмен веществ в мозге, применяется при лечении всевозможных нарушений его деятельности – последствий травм головного мозга, гипоксии, перенесенной в родах и во время беременности, улучшает состояние при депрессиях, неврозах всех видов – от нервных тиков до панических атак.

Глицин (глицин форте), инструкция по применению препарата

Фармакологическое действие:
Заменимая аминокислота, центральный нейромедиатор тормозного типа действия. Улучшает метаболические процессы в тканях мозга, оказывает антидепрессивное и седативное действие. Обладает глицин- и ГАМК-ергическим, альфа1-адреноблокирующим, антиоксидантным и антитоксическим действием; регулирует деятельность глутаматных (NMDA) рецепторов, за счет чего уменьшает психоэмоциональное напряжение, агрессивность и конфликтность; улучшает социальную адаптацию и настроение; облегчает засыпание и нормализует сон; повышает умственную работоспособность; уменьшает выраженность вегетативно-сосудистых нарушений (в т.ч. и в климактерическом периоде) и общемозговых расстройств при ишемическом инсульте и черепно-мозговой травме, токсическое действие этанола на ЦНС. Эффективен в качестве вспомогательного средства при эпилептических приступах.

Показания:
Стрессовые состояния (в т.ч. психоэмоциональное напряжение), снижение умственной работоспособности, девиантные формы поведения детей и подростков, различные функциональные и органические заболевания нервной системы, сопровождающиеся повышенной возбудимостью, эмоциональной нестабильностью, снижением умственной работоспособности и нарушением сна: неврозы, неврозоподобные состояния, последствия нейроинфекций и ЧМТ, перинатальные и др. формы энцефалопатий (в т.ч. алкогольного генеза). Ишемический инсульт. В наркологии – в качестве ЛС, повышающего умственную работоспособность и уменьшающего психоэмоциональное напряжение в период ремиссии при явлениях энцефалопатии, органических поражениях центральной и периферической нервной системы.

Противопоказания:
Гиперчувствительность.C осторожностью. Артериальная гипотензия.

Побочные действия:
Аллергические реакции.

Способ применения и дозы:
Сублингвально или трансбуккально по 100 мг (в таблетках или в виде порошка после измельчения таблетки). Практически здоровым детям, подросткам и взрослым при психоэмоциональных напряжениях, снижении памяти, внимания, умственной работоспособности, задержке умственного развития, при девиантных формах поведения глицин назначается по 100 мг 2-3 раза в день в течение 14-30 дней. При функциональных и органических поражениях нервной системы, сопровождающихся повышенной возбудимостью, эмоциональной лабильностью и нарушением сна, детям до 3 лет назначают по 50 мг 2-3 раза в день в течение 7-14 дней, в дальнейшем по 50 мг 1 раз в день на протяжении 7-10 дней. Суточная доза – 100-150 мг, курсовая – 2-2.6 г. Детям старше 3 лет и взрослым назначают по 100 мг 2-3 раза в день, курс лечения – 7-14 дней, его можно увеличить до 30 дней, при необходимости курс повторяют через 30 дней. При нарушениях сна назначают за 20 мин до сна или непосредственно перед сном по 50-100 мг (в зависимости от возраста). При ишемическом мозговом инсульте: в течение первых 3-6 ч от развития инсульта назначают 1 г трансбукально или сублингвально с 1 ч.ложкой воды, далее в течение 1-5 сут по 1 г/сут, затем в течение последующих 30 сут по 100-200 мг 3 раза в сутки. В наркологии – по 100 мг 2-3 раза в день в течение 14-30 дней. При необходимости курсы повторяют 4-6 раз в год.

Особые указания:
У пациентов с наклонностью к артериальной гипотензии назначение производится в меньших дозах и при контроле АД, при его снижении ниже привычного уровня прием прекращается.

Взаимодействие:
Ослабляет выраженность побочных эффектов антипсихотических ЛС (нейролептиков), анксиолитиков, антидепрессантов, снотворных и противосудорожных ЛС.

Это инструкция и описание препарата из официальных источников. Как я уже говорил, неврологи и терапевты охотно назначают глицин в качестве поддерживающего и успокоительного средства, реже в виде монотерапии. Многие пациенты отмечают положительное действие препарата, а многие говорят что не заметили никаких изменений с началом приема глицина. Лично я думаю, что так и есть на самом деле: 50 на 50. Какой-то части больных глицина достаточно в виде плацебо, на другую часть глицин действительно оказывает положительное действие, а остальным прием препарата, как говорится, “по барабану”. Я, к сожалению, отношусь к третьей, можно считать, что мне не повезло 🙂 А вот моя тёща с удовольствием закидывает под язык пару таблеток и утверждает, что стала быстрее засыпать и “вообще стало лучше”. Вот и пожалуйста, тёща, как минимум, в первой группе. Ну и слава Богу, как говорится 🙂

На медицинских форумах довольно часто можно встретить отрицательные (вернее, нейтральные) отзывы о глицине от врачей. И это при том, что глицин – чуть ли не самый назначаемый препарат! Положительные отзывы о глицине гораздо чаще можно встретить от пациентов, которые имеют личный опыт лечения глицином. Почему сложилась такая ситуация? Все довольно просто: нейтральные отзывы исходят в основном от продвинутых специалистов, которые придерживаются “западных технологий лечения”, в которых принято рекомендовать только те препараты, которые имеют достоверно доказанную эффективность, т.е. прошли всесторонние многолетние документированные исследования. В принципе, это правильно. Почему в таком случае глицин назначает огромное количество врачей в нашей стране? Тут тоже все просто: глицин – препарат безобидный, нанести им вред, собственно, невозможно. А вот помочь он действительно может. Не всегда, но может! Да и стоит три копейки… Почему бы и не назначить?

Что делать больному? А тут, на мой взгляд, тоже все просто. Учитывая низкую стоимость препарата и довольно большую часть положительных отзывов можно рекомендовать попробовать терапию глицином практически каждому пациенту. Не будет положительного эффекта – надо будет искать другие средства. А поможет – так это ж очень и очень здорово!

Только прошу вас учесть одно: я не врач, я только выражаю собственное мнение. Хоть оно и основано на личном опыте… Поэтому:

не принимайте препарат без предварительной консультации со специалистом!

Ну и по традиции большая просьба к посетителям: уделите пару минут, оставьте отзыв о препарате глицин, если, конечно, у вас есть личный опыт лечения данным препаратом. Заранее благодарю!

Комментарии (из архива):

Wave 25.02.2014
Глицин является весьма активным препаратом, и это также “физиологичный препарат”, поскольку это заменимая аминоуксусная кислота. Как и написано в описании “Глицина”, это препарат тормозного типа действия, обладающий ГАМК- и глицинэргическими свойствами. В организме человека есть глициновый рецептор, что уже должно говорить о многом; аминокислота глицин является, таким образом, исполняющей регулирующие ф-ции, и именно поэтому при различных состояниях эффекты от приёма глицина широко варьируют – от выраженной сонливости – до активности, а в итоге – прём глицина ведёт к гармонизации процессов торможения и возбуждения в ЦНС, и не такое это и “простое” вещество, если вспомнить либо ГАМК, либо ГОМК.

Посредством ГАМК реализуют свои эффекты бензодиазепиновые транквилизаторы, мепробамат, алкоголь тот же и пр., а рецептор глицина – это, возможно, необычайно важный рецептор, одна его связь с эндогенной каннабиноидной системой говорит о многом.

Майя 25.02.2014
Здравствуйте! По собственному опыту НЕОДНОКРАТНЫХ проб по приему данного препарата могу сделать вывод – НОЛЬ ЭМОЦИЙ!!! Ну никак он на меня не действует! Читала отзывы о его чудодейственном влиянии чуть ли не с первой таблетки – и работоспособность усиливается, и нервы успокаиваются, и ещё много-много всего-всего – очень удивляюсь, но по мне – хоть всю пачку съешь – разве, что сыпью покроешься!!! )))

Doc (Автор) 25.02.2014
Аналогично! Иногда закидываю под язык скорее “на автомате”, в надежде “а вдруг сегодня что-то изменится” 🙂 Но с другой стороны жена с одной таблетки форте как овощ. Вот такие дела

алексей 04.06.2014
Много лет принимаю периодически, изменений в состоянии здоровья не ощутил. Скорее машинально-а вдруг поможет)))

Юлия 20. 07.2014
Пробовала принимать “Глицин” не однократно… Результат – всё, как описано в инструкции да вот только наоборот. Глицин успокаивает? Меня- нет. Организм, вообще, как-то странно на него “реагирует” : нервозность увеличивается, АД подскакивает, иногда бывает мышечный тремор и, ко всему “хорошему”, подключаются панические атаки. Врач сказал – “Ну, значит Вам не подходит”.

Роман 07.08.2014
Помню вызвал скорую как то. Была паническая атака и сильное сердцебиение, или наоборот)). Тогда я ещё ничего не знал о своих болезнях, долго не обследовался. При недомогании тупо выпивал водки, легчало конечно )), пил то я каждый вечер.

Так вот, врач сделал кардиограмму и сказал съесть десять таблеток глицина (не форте). Я сильно удивился количеству и переспросил несколько раз, потом съел. К моему удивлению стало лучше. Это конечно максимальная доза по моему, но и случай был подходящим, я думал кирдык вообще.
Вот так познакомился с глицином, теперь иногда ем для профилактики, а иногда при “сердцебиении”. Хотя вру, теперь не ем, теперь по лестнице хожу вместо перекура, раньше курил.
П.С. Сделайте шрифт комментариев такой же как в статьях, а чтобы отделялся можно чуть другого оттенка. Так комменты трудно воспринимаются.
Могу помочь в этом, работаю с web.

Рамиля Семенова 08.09.2014
Мне глицин помогал 10 лет назад ,но и была моложе. Сейчас считаю это пустышка.

Елена 19.09.2014
Могу сказать что в начале приемов он действительно помагал (при первых симптомах головокружения принимала – и все исчезало), а сейчас иногда принимаю если предстоит волнение или ребенку даю когда психует и не может остановиться – его попускает.

Татьяна 07.10.2014
Мне он как то не пошел.. Зато отлично помогает Тенотен. Когда чувствую, что нужно успокоиться – таблетку под язык и все норм)
А если приступ ВСД, то валидол очень хорошо снимает.

галина 13.12.2014
мне пришлось давать глицин двум внучкам возраст которых: одной 6 лет..другой 4 годика.Так вот глицин на одну внучку действовал успокаивающее, а на другую наоборот возбуждающе ( и даже очень сильно ). . Затем я узнала..(источник не помню..) что действие глицина не одинаково…так что давая детям присмотритесь как они реагируют на него..

Sanny 26.01.2015
Мы тоже пьем глицин, чаще всех дочь (студентка меда) до и во время сессии, помогает- учится и запоминается легче, ну и я иногда пью, например, когда предстоит напряженная работа, требующая концентрации и внимания, а вот насчет сна… это точно не про меня) не успокаивает… И до кучи, с младшей дочерью был неприятный инцидент, в подробности вдаваться не буду, это была ЗЧМТ, а через пару недель начались припадки. Через что мы прошли, словами не описать, а вот вылечились очень легко и просто глицин+диуретик по определенной схеме, ребенок пришел в нормальное состояние за месяц.

ира 01.02.2015
а мне глицин хорошо помогает конечно я его пью не по 2 таблетки.а по 5. голова лучше соображать начинает и тревожность уходит.

Серж 24.04.2015
Мне глицин также не помог, хотя знакомая от него в восторге. На одном из форумов прочел, как мне показалось, очень разумное объяснение этому “феномену”. Всё дело в том, чем у кого вызвана его проблема: если отсутствием этой аминокислоты-он поможет, если чем-то другим-нет. Я опытным путем установил, что у меня нарушения связаны с норадреналином, поэтому эффект дают препараты, регулирующие его обмен, тот же ладисан.

Мария 16.07.2015
Только с помощью глицина избавилась от панических атак. Когда перепробывала все на свете, объездила всех врачей, случайно на одном из форумов ВСДшников прочитала коменты одной девушки, где она описывала свою историю избавления от ВСД и ПА. Думаю: а почему бы не попробывать, цена копеечная, ничего не теряю. Начала принимать по 1 т 3 раза в день. Позже очередной невролог посоветовал принимать по 2т., а на ночь 3т. Под язык. Мол хуже не будет. После нескольких пачек про панические атаки забыла. Но глицин принимаю и сейчас. В основном, когда понервничаю, или при смене погоды при плохом самочувствии или просто так ( на всякий случай).

Крестик 17.07.2015
как по мне, так препарат хорош. в течение недели не могла избавится от страха, головная боль, судороги в ногах, беспокойный сон и трясущиеся руки, все не давало покоя, сказывался стресс на работе, дома и в личной жизни, ревела постоянно. посоветовала глицин знакомая. три дня отсыпалась почти сутками, до этого не могла спокойно поспать и пары часов, состояние нормализовалось, правда нахожусь как в прострации, сейчас нет никакого настроения видно сказывается эмоциональное истощение, головные боли все реже, руки в спокойствии и нет ничего что беспокоило меня ранее, проблемы ни куда не пропали, все на том же месте , но теперь ко всему спокойное отношение, на работе переделала все то что планировала на неделю за один день. концентрация улучшилась. как по мне так это достаточно хорошее и действенное средство.)

Vadim 04.08.2015
Ноотропы действуют только в случае если вы активно пользуетесь головой( выработка ацетилхолина)

Наталья 31.08.2015
В связи с постоянной тревогой, головокружениями, отсутствием сна, сил, памяти, мышечными болями и т.п. (весь букет симптомов всд и депрессии) врач назначил антидепрессанты. Пить их не смогла,вылезли страшные побочки, состояние стало ещё намного хуже, чем было. Сейчас принимаю глицин, по 2 табл 3 раза в день. . Я не ожидала, но он мне помог!!! За 2 недели пропало большинство симптомов, встаю утром без чувства тревоги, мышцы не болят, голова стала соображать, стала делать дела. Спасибо подруге, которая мне его посоветовала. Пейте не Эвалар, а обычные маленькие… Разница есть

Глицин — для чего он нужен и как его принимать

Обновлено 22 июля 2021 Просмотров: 168 613 Автор: Дмитрий Петров
  1. Для чего нужен глицин
  2. Формула
  3. Показания к применению
  4. Использование в лечении детей
  5. Как принимать глицин
  6. Противопоказания
  7. Особые рекомендации
  8. Чем можно заменить глицин
  9. Отзывы врачей и пациентов

Здравствуйте, уважаемые читатели блога KtoNaNovenkogo.ru. Глицин у многих на слуху, и это неудивительно: в наше время непросто справиться с нервами в одиночку.

Однако прежде чем считать глицин надежным соратником в борьбе с волнением, стоит узнать о препарате как можно больше.

Моя сегодняшняя миссия – информировать вас об особенностях медикамента, рассказать для чего нужен глицин, как принимать препарат и не навредить себе.

Как действует и для чего нужен глицин

Глицин – это метаболическое средство, которое справляется с регулированием обмена веществ.

Лекарство снижает психоэмоциональное напряжение, увеличивает работоспособность мозга, а также:

  1. увеличивает социальную адаптацию;
  2. налаживает сон;
  3. сокращает проявления вегето-сосудистого расстройства;
  4. унимает симптомы мозговых расстройств;
  5. сокращает токсичность алкогольных напитков и лекарств, угнетающих ЦНС.

Формула глицина

Формула активного вещества (аминоуксусная кислота, аминоэтановая кислота) — NH₂-CH₂-COOH.

Вещество оказывается в биологических жидкостях в организме человека.

Процесс метаболизма завершается образованием воды и углекислого газа. Активный компонент не накапливается в тканях, выводится естественным образом.

Показания к применению

Лист показаний к использованию лекарства широк. Если кратко, то глицин нужен для борьбы со следующими проявлениями:

  1. девиантное поведение подростка, ребенка;
  2. увеличенная психоэмоциональная нагрузка, стимулированная стрессовой ситуацией;
  3. эмоциональная нестабильность;
  4. низкая умственная трудоспособность, вызванная патологиями ЦНС, хроническим переутомлением;
  5. заболевания головного мозга, вызванные черепно-мозговой травмой, отравлением веществами;
  6. вегето-сосудистая дистония;
  7. неврозы и подобные явления;
  8. последствия инсульта;
  9. плохой сон по ночам.

Этот же препарат нередко прописывают метеочувствительным людям в период резких перепадов температур и атмосферного давления. Аминокислота не навредит и спортсменам – компонент позволит быстро восстановиться после физических нагрузок.

Использование в лечении детей

Если педиатры рекомендуют давать детям глицин, обеспокоенные мамы не понимают, для чего он нужен ребенку.

Аминокислота может быть использована в лечении даже самых маленьких – новорожденных детей. Глицин помогает малышам и детям постарше справиться с беспокойством, адаптироваться к меняющейся обстановке.

Применение препарата вполне оправдано и при гиперактивности и рассеянности ребенка, подростка.

Средство способствует улучшению памяти, восприятия информации, поможет подготовиться к экзаменам, соревнованиям.

Как принимать глицин

Традиционная доза лекарства – 100 мг (1 таблетка). Пилюлю нужно держать под языком до полного растворения. Если у пациента невроз, поражения ЦНС, для нормализации эмоционального состояния назначают по 1 пилюле 2-3 раза в сутки.

Продолжительность терапии – 7-14 дней. Курс можно продлить до 27-30 дней. Повторно возобновить использование таблеток можно только спустя месяц после окончания курса.

В таблице ниже приведены рекомендуемые дозировки препарата при различных состояниях. До использования средства в любом случае стоит проконсультироваться с врачом.

Состояние/группа пациентовРекомендуемая доза/длительность курса
Расстройство снастартовая доза – ½-1 таблетка за 20 минут до сна
Ишемический мозговой инсульт
  1. 1000 мг медикамента с 1 ч.л. воды в течение первых 3-6 часов
  2. 1000 мг в сутки на протяжении последующих 1-5 суток
  3. 1-2 пилюли 3 раза в день на протяжении месяца
Энцефалопатия, органические поражения ЦНС и ПНС1 таблетка 2-3 раза в 24 часа (продолжительность курса 2-4 недели). Повторять курс на протяжении года от 4 до 6 раз
Патологии у ребенка старше 3 лет1 таблетка 2-3 раза в день. Наибольшая продолжительность курса – месяц. Интервалы между лечением – 30-35 суток
Патологии у подростковКурс не превышает 4 недели. Традиционно глицин дают подросткам на протяжении 1-2 недель

Противопоказания

Глицин нежелательно применять в период беременности и лактации, поскольку степень вредности препарата в таких случаях не определена.

Если у пациента гипотония, пить медикамент стоит осторожно, регулярно измеряя артериальное давление. При условии оказания негативного влияния препарата его дозу следует сократить или вовсе отказаться от терапии.

Если много пить глицина водителям транспортных средств, это может сказаться на качестве вождения: препарат притормаживает реакцию.

Особые рекомендации

Местная аппликация Глицином используется в процессе трансуретральной резекции простаты. Препарат может попадать в системный кровоток и оказывать влияние на состояние почек и сердечно-легочной системы. Особенно это актуально в случае с «сердечниками».

Из побочных реакций средства можно выделить аллергическую реакцию в случае индивидуальной непереносимости компонентов лекарства.

Препарат ослабляет выраженность побочных явлений от приема антипсихотических средств, антидепрессантов, снотворного, противосудорожных медикаментов.

Чем можно заменить глицин

Аналоги глицина имеют в своем составе иные активные компоненты, но при этом принцип их действия аналогичен.

В таблице ниже приведу список наиболее распространенных аналогов, здесь же дам краткую характеристику препаратам:

Название лекарстваОписание
МексидолВосстанавливает мозговую деятельность, вспомогательное средство для борьбы с абстинентным синдромом.
НейротропинПрименяется при дисциркуляторных заболеваниях мозга, уменьшает проявление тревожности.
ТриптофанАминокислота помогает при предменструальном синдроме, депрессивном расстройстве.
ЭлфунатВосстанавливает кровоснабжение головного мозга, когнитивные функции.
АрмадинЛекарство широкого спектра действия, помогает при невротическом расстройстве, вспомогательное средство при заболеваниях брюшной полости.
ИнстенонПрименяется при лечении болезней сосудистой системы, помогает восстановиться после инсульта, при функциональных расстройствах головного мозга.

Аналогичное действие медикаментов не дает оснований бесконтрольно заменять одно лекарство другим.

При подборе аналога важно проконсультироваться с доктором.

Отзывы врачей и пациентов

Судя по мнению врачей, специалисты считают глицин хорошим препаратом, который быстро демонстрирует эффект: повышает работоспособность, налаживает сон, успокаивает.

К препарату пациенты не привыкают, не становятся заторможенными. Особенно ценят средство за минимум противопоказаний и отсутствие побочной реакции.

Пациентов глицин также не разочаровывает: чаще всего таблетки пьют накануне экзаменов и прочих волнительных событий.

Многие считают лекарство самым лучшим успокоительным, которое не только помогает справиться с волнением, но и стоит недорого.

Глицин действительно заслуживает похвалы, однако, даже такое достойное средство от стресса должно применяться только по назначению лечащего врача.

На сегодня у меня все, друзья! Будьте здоровы и не волнуйтесь по пустякам 🙂 .

Автор статьи: детский врач-хирург Ситченко Виктория Михайловна

Удачи вам! До скорых встреч на страницах блога KtoNaNovenkogo.ru

Эта статья относится к рубрикам:

Связь между глицином и сном

Эта аминокислота улучшает сон и поддерживает здоровье всего тела

Возможно, вы не знаете его по имени, но крошечная аминокислота глицин сейчас усердно работает в вашем теле, поддерживая силу и поддержку ваших мышц и костей, помогая поддерживать нормальный обмен веществ, поддерживая здоровый мозг и способствуют хорошему ночному сну.

Несмотря на всю свою способность поддерживать здоровье и естественную способность организма к исцелению, глицин как естественное средство не привлекает удивительно мало внимания.Давайте посмотрим на то, что мы знаем сегодня о глицине: как он действует в организме и какое дополнительное количество глицина может повлиять на ваше здоровье и сон.

Что такое глицин?

Глицин (также известный как 2-аминоуксусная кислота ) представляет собой аминокислоту и нейромедиатор. Организм сам вырабатывает глицин, синтезируемый из других природных биохимических веществ, чаще всего из серина, но также из холина и треонина. Мы также потребляем глицин с пищей. Эта аминокислота содержится в продуктах с высоким содержанием белка, включая мясо, рыбу, яйца, молочные продукты и бобовые.Ежедневный рацион обычно включает около 2 граммов глицина.

Глицин — нейротрансмиттер, обладающий возбуждающей и тормозящей способностью, то есть он может действовать как для стимуляции активности мозга и нервной системы, так и для ее успокоения.

Люди используют глицин в качестве пероральной добавки для различных целей, включая улучшение сна, улучшение памяти и повышение чувствительности к инсулину. Глицин также доступен в форме для местного применения и используется для заживления ран и лечения кожных язв.

Глицин имеет сладкий вкус, выпускается в промышленных масштабах как подсластитель и включается в такие продукты, как косметические средства и антациды. Его название происходит от греческого слова гликыс , что означает «сладкий».

Глицин иногда используется при лечении шизофрении, как правило, вместе с обычными лекарствами, чтобы уменьшить симптомы. Глицин также назначают перорально пациентам, перенесшим ишемический инсульт (наиболее распространенный тип инсульта), в качестве лечения, помогающего ограничить повреждение мозга в течение первых шести часов после инсульта.

Как работает глицин?

Глицин считается одной из важнейших аминокислот для организма. Он оказывает широкое влияние на системы, структуру и общее состояние нашего организма, включая сердечно-сосудистую, когнитивную и метаболическую системы. Вот некоторые из наиболее важных и хорошо изученных ролей, которые глицин играет в нашем здоровье и функционировании:

Как аминокислота, глицин работает как строительный белок в организме. В частности, глицин способствует выработке коллагена — белка, который является важным компонентом мышц, сухожилий, кожи и костей.Коллаген — это наиболее часто встречающийся белок в организме, составляющий примерно треть всех белков организма. Он не меньше, чем придает телу его фундаментальную структуру и силу. Коллаген — это белок, который помогает коже сохранять эластичность. Глицин также способствует выработке креатина, питательного вещества, которое хранится и используется как мышцами, так и мозгом для получения энергии.

Глицин участвует в пищеварении, в частности, в расщеплении жирных кислот в пищевых продуктах. Это также помогает поддерживать здоровый уровень кислотности в пищеварительном тракте.

Глицин также участвует в производстве организмом ДНК и РНК, генетических инструкций, которые доставляют клеткам нашего тела информацию, необходимую им для функционирования.

Эта аминокислота помогает регулировать уровень сахара в крови и перемещать его к клеткам и тканям по всему телу для использования в качестве энергии.

Глицин помогает регулировать иммунный ответ организма, ограничивать нездоровое воспаление и ускорять заживление.

В качестве нейромедиатора глицин как стимулирует, так и подавляет клетки мозга и центральной нервной системы, влияя на познание, настроение, аппетит и пищеварение, иммунную функцию, восприятие боли и сон.Глицин также участвует в производстве других биохимических веществ, влияющих на эти функции организма. В частности, глицин помогает организму вырабатывать серотонин, гормон и нейромедиатор, который оказывает значительное влияние на сон и настроение. Он также влияет на ключевые рецепторы мозга, влияющие на обучение и память.

Преимущества глицина

Для сна : Глицин влияет на сон несколькими способами. Исследования показывают, что более высокий уровень этой аминокислоты может:

  • Помогает вам быстрее заснуть
  • Повышает эффективность сна
  • Уменьшает симптомы бессонницы
  • Улучшает качество сна и способствует более глубокому и более спокойному сну

Как глицин выполняет всю эту работу по улучшению сна? Похоже, что он влияет на сон по крайней мере двумя важными способами:

Глицин снижает температуру тела .Глицин увеличивает приток крови к конечностям, что снижает внутреннюю температуру тела. Я уже писал ранее о том, как колебания температуры тела влияют на циклы сна и бодрствования, а также на вашу способность засыпать вначале. Небольшое понижение температуры тела — ключевая часть физического процесса засыпания. Недавнее исследование эффектов глицина в качестве добавки показало, что он вызывает снижение температуры тела и в то же время помогает людям быстрее засыпать и проводить больше времени в фазе быстрого сна.Другое исследование показало, что дополнительный прием глицина может помочь вам быстрее погрузиться в глубокий медленный сон.

Глицин повышает уровень серотонина. Серотонин имеет сложную связь со сном. Помимо прочего, серотонин необходим для выработки гормона сна мелатонина. У людей, страдающих нарушениями сна или нарушениями сна, такими как бессонница и апноэ во сне, повышение уровня серотонина может помочь восстановить здоровый режим сна и способствовать более глубокому, более спокойному и освежающему сну.Исследования показывают, что пероральный глицин повышает уровень серотонина, уменьшает симптомы бессонницы и улучшает качество сна. Другие исследования показывают, что это может помочь вам вернуться к здоровому циклу сна после периода нарушенного сна.

Для улучшения когнитивных функций и памяти : Глицин активен в гиппокампе, области мозга, важной для памяти и обучения. В форме добавки глицин, по-видимому, оказывает положительное влияние на когнитивные функции в дневное время. В том же исследовании, которое показало, что добавка глицина облегчает засыпание и переход к медленноволновому сну, ученые также обнаружили, что люди получают более высокие баллы в дневных когнитивных тестах.Также было показано, что дополнительный глицин улучшает память и внимание у молодых людей. Ученые активно исследуют использование глицина при лечении нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера.

Для здоровья сердечно-сосудистой системы: Глицин поддерживает здоровье иммунной системы и сдерживает воспаление, обеспечивая защиту сердечно-сосудистой системы. Он также действует как антиоксидант, помогая задерживать и удерживать поврежденные клетки, которые могут вызвать заболевание.Более высокий уровень глицина был связан с более низким риском сердечного приступа, и есть некоторые свидетельства того, что глицин может помочь защитить от высокого кровяного давления. Тем не менее, полная связь между глицином и здоровьем сердечно-сосудистой системы — это то, над чем ученые все еще работают, чтобы лучше понять.

Для здоровья суставов и костей: Глицин — одна из самых важных аминокислот в организме, питающих белок. Он снабжает наши мышцы, кости и соединительные ткани коллагеном — белком, который необходим для вашей силы, стабильности и здорового физического состояния.С возрастом уровень коллагена в организме естественным образом снижается. Глицин также очень эффективен при подавлении воспаления. Дополнительные дозы глицина могут помочь укрепить кости и суставы и предотвратить артрит.

Для улучшения обмена веществ: Глицин играет важную роль в здоровом обмене веществ. Низкий уровень глицина связан с повышенным риском развития диабета 2 типа. С другой стороны, более высокие уровни глицина связаны с более низким риском этого метаболического нарушения.Но пока не ясно, каковы причина и следствие этой связи: непосредственно ли низкий уровень глицина способствует метаболической дисфункции , ведущей к диабету, или является результатом уже имеющейся метаболической дисфункции .

Исследования показывают, что глицин может эффективно снижать уровень сахара в крови и увеличивать выработку инсулина у здоровых взрослых. Исследования показали, что у людей с диабетом 2 типа дефицит глицина может быть уменьшен с помощью перорального приема глицина.Другие исследования показывают, что у людей с диабетом пероральный глицин может снизить уровень сахара в крови.

Глицин: что нужно знать

Всегда консультируйтесь с врачом, прежде чем начинать прием добавок или вносить какие-либо изменения в существующий режим приема лекарств и добавок. Это не медицинский совет , а информация, которую вы можете использовать в качестве начала разговора со своим врачом при следующем посещении.

Дозирование глицина

Для сна : 3-5 граммов глицина, принимаемых перорально перед сном, были эффективно использованы для улучшения сна в научных исследованиях.

Для сахара в крови : В научных исследованиях для снижения уровня сахара в крови эффективно используется диапазон 3-5 граммов глицина, принимаемых перорально во время еды.

Возможные побочные эффекты глицина

Глицин обычно хорошо переносится здоровыми взрослыми. Побочные эффекты встречаются редко, но могут включать:

  • Тошнота
  • Рвота
  • Легкое расстройство желудка
  • Мягкий стул

Взаимодействие с глицином

Это обычно используемые лекарства и добавки, которые имеют научно подтвержденное взаимодействие с глицином.Люди, которые принимают эти или любые другие лекарства и добавки, должны проконсультироваться с врачом, прежде чем начинать использовать глицин в качестве добавки.

Беременные или кормящие женщины . Рекомендуется избегать использования глицина во время беременности и кормления грудью, прежде всего потому, что в настоящее время нет достаточных доказательств безопасности использования в этих условиях.

Взаимодействие с лекарствами

Клозапин . Этот препарат (торговая марка Clozaril) используется при лечении шизофрении.Использование глицина в сочетании с клозапином может снизить эффективность клозапина. Людям, принимающим клозапин, не рекомендуется использовать глицин.

Взаимодействие с другими дополнениями

В настоящее время не известно о взаимодействии с травами и добавками.

Когда вы говорите со своим врачом о приеме глицина, обязательно укажите информацию о добавках, которые вы уже принимаете.

Глицин — это довольно интересный природный биохимический продукт, преимущества которого простираются от физиологического здоровья, силы и жизнеспособности до более сильной умственной деятельности и улучшения сна.Я ожидаю, что из-за его широкого воздействия мы увидим повышенное внимание к тому, как дополнительный глицин может помочь нам защитить наше здоровье и наш сон.

Sweet Dreams,

Майкл Дж. Бреус, PhD, DABSM

Доктор сна ™

www.thesleepdoctor.com

Майкл Бреус, доктор философии — доктор сна, дипломант Американского совета по медицине сна и член Американской академии медицины сна, а также один из 168 психологов, прошедших Специализированный совет по медицине сна, не посещая медицинский институт.Д-р Бреус — востребованный лектор, и его знания ежедневно публикуются в основных национальных средствах массовой информации по всему миру, включая Today, Dr. Oz, Oprah и в течение четырнадцати лет в качестве эксперта по сну по WebMD. Доктор Бреус — автор бестселлеров «Сила времени», «План диеты доктора снов» и «Спокойной ночи!»

границ | Высокопроизводительные методы обнаружения новых модуляторов рецепторов глицина и их сайтов связывания

Состав, распределение и функции субъединиц

Ингибирующий глициновый рецептор (GlyR) является членом семейства рецепторов, управляемых лигандом Cys-петли, которое также включает никотиновый ацетилхолиновый рецептор (nAChR), рецептор GABA типа A (GABA A R) и рецептор серотонина типа 3. (5-HT 3 R).Рецепторы этого класса состоят из пяти субъединиц, симметрично расположенных вокруг центральной ионопроводящей поры. Каждая субъединица включает четыре α-спиральных трансмембранных домена и большой внеклеточный аминоконцевой домен, в котором находятся сайты связывания лиганда и сигнатура «Cys-петля» (Unwin, 2003 ; Хильф и Дутцлер, 2008 г. ). На данный момент идентифицировано в общей сложности пять субъединиц GlyR, а именно α1 − α4 и β (Betz and Laube, 2006 ; Линч, 2009 ). Ген α4 является псевдогеном у человека (Simon et al., 2004 ).Все субъединицы α могут образовывать функциональные гомомерные рецепторы, но субъединица β функционально экспрессируется только как гетеромер с субъединицей α в предполагаемой стехиометрии 2α: 3β (Grudzinska et al., 2005 ). У взрослой крысы мРНК субъединицы α1 в большом количестве присутствует в стволе головного мозга, спинном мозге и сетчатке, но также обнаруживается в верхних и нижних бугорках, таламусе и гипоталамусе (Malosio et al., 1991 ). Выражение пренатально низкое, но увеличивается от рождения и достигает максимума к концу третьего постнатального слабого развития.Распределение и профиль развития субъединицы α3 аналогичны, но встречаются на более низких уровнях, за исключением сетчатки и спинного мозга, как обсуждается ниже (Malosio et al., 1991 ; Ватанабэ и Акаги, 1995 г. ). Напротив, субъединица α2 присутствует на высоких уровнях пренатально, но снижается постнатально до низких уровней у взрослых (Malosio et al., 1991 ; Ватанабэ и Акаги, 1995 г. ). Субъединица β, которая обнаруживает удивительно широкое распространение в спинном и головном мозге, также увеличивается с возрастом параллельно с субъединицами α1 и α3.Тормозная синаптическая передача в моторных рефлекторных цепях спинного мозга опосредуется α1β GlyR. Это, вероятно, лучше всего подтверждается тем фактом, что наследственные мутации в α1 GlyR, которые снижают скорость передачи заряда синаптических α1β GlyR, вызывают у человека болезнь испуга, расстройство, характеризующееся временным увеличением мышечной жесткости, но без изменения когнитивного состояния (Bakker et al. ., 2006 ). Сетчатка выражает разнообразие субъединиц GlyR. Постулируется, что синаптические GlyR, содержащие α1β, α2β и α3β GlyR, присутствуют в анатомически дискретных местах, хотя их индивидуальный вклад в визуальную обработку еще предстоит выяснить (Balse et al., 2006 г. ; Ge et al., 2007 ; Грюнерт и Вассл, 1993 ; Грюнерт и Гош, 1999 г. ; Хаверкамп и др., 2003 г. , 2004 г. ; Юсуф и др., 2005 г. ; Маджумдар и др., 2007 г. ; Веруки и др., 2007 г. ). Субъединица α2 GlyR также играет решающую роль в развитии фоторецепторов палочек (Young and Cepko, 2004 ). Глицинергические синапсы также обнаруживаются в нескольких ядрах ствола мозга, особенно в ядрах центральных слуховых путей (Caspary et al., 2008 ), где большие быстрые глицинергические синаптические токи важны для точного определения времени, связанного с направленным слушанием (Kandler, 2004 ).Внесинаптические GlyR широко распространены по всей нервной системе взрослых в таких областях, как кора головного мозга (Flint et al., 1998 ), гиппокамп (Mori et al., 2002 ) и базолатеральной миндалины (McCool and Farroni, 2001 ), где считается, что они опосредуют тоническое подавление. Экспрессия GlyR не ограничивается нейронами, но также обнаруживается в сперматозоидах, где GlyR участвуют в акросомной реакции, которая сливает сперму с яйцеклеткой (Meizel, 1997 ). GlyR также были идентифицированы в макрофагах и лейкоцитах, где, как считается, они опосредуют противовоспалительные эффекты глицина (Gundersen et al., 2005 г. ).

Терапевтический потенциал GlyRs

Расстройства движения

Поскольку α1β GlyRs контролируют возбудимость спинномозговых мотонейронов, агенты, которые увеличивают ток через α1-содержащие GlyRs, должны снижать активность этих нейронов. Таким образом, α1-специфические усиливающие агенты могут быть полезны в качестве средств лечения вздрагивания и в качестве миорелаксантов при гипертонических двигательных расстройствах, таких как спастичность. Такие двигательные расстройства в настоящее время лечат с помощью бензодиазепинов, усиливающих GABA A R, которые имеют существенные побочные эффекты из-за широкого распространения целевых GABA A Rs по всему мозгу.Напротив, их относительно ограниченное распределение делает α1β GlyR более перспективной терапевтической мишенью.

Противовоспалительное обезболивающее

Субъединицы GlyR α1 и α3 сосуществуют в отдельных глицинергических ингибирующих синапсах на ноцицептивных сенсорных нейронах в спинном роге спинного мозга (Harvey et al., 2004 ). Медиатор воспаления, простагландин E 2 , действующий на рецептор EP 2 , специфически ингибировал оба глицинергических ингибирующих постсинаптических тока (IPSC) в сенсорных нейронах боли (Ahmadi et al., 2002 г. ; Харви и др., 2004 г. ) и глициновые токи в рекомбинантно экспрессируемых α3 (но не α1) GlyR (Harvey et al., 2004 ), подразумевая, что воспалительная сенсибилизация боли опосредуется ингибированием глицинергических IPSC. В соответствии с этим, нокаут либо субъединицы α3 GlyR, либо рецептора EP 2 у мышей устраняет болевую сенсибилизацию, вызванную периферическим воспалением (Harvey et al., 2004 ; Рейнольд и др., 2005 г. ). Таким образом, воспалительная сенсибилизация боли вызывается опосредованной PGE 2 подавляющей регуляцией α3-опосредованных глицинергических IPSC в ноцицептивных нейронах.Это, в свою очередь, означает, что молекулы, которые могут специфически усиливать или продлевать IPSC в ноцицептивных нейронах спинного мозга, являются многообещающими противовоспалительными анальгетическими соединениями свинца. Хотя должно быть возможно компенсировать влияние медиаторов воспаления на α3-содержащие GlyR путем фармакологического усиления переноса заряда через синаптические α1-содержащие GlyR, риск побочных эффектов выше, учитывая, что субъединицы α1 более широко распространены за пределами спинного рога. (Линч и Каллистер, 2006 г. ; Цайльхофер, 2005 г. ).

Иммуномодуляция

Функциональные GlyR присутствуют в иммунных клетках, включая нейтрофилы (Wheeler et al., 2000). ), макрофаги и лейкоциты (Froh et al., 2002 ; Икедзима и др., 1997 г. ). Появляется все больше доказательств того, что GlyR в этих клетках опосредуют противовоспалительное и цитопротекторное действие глицина, противодействуя увеличению внутриклеточного кальция, которое опосредует активацию этих клеток (Froh et al., 2002 ; Икедзима и др., 1997 г. ). Таким образом, подавляя активность иммунных клеток, системное введение глицина или потенцирующих агентов GlyR может ограничить повреждение, наносимое системным воспалительным иммунным ответом основным биологическим молекулам, клеткам и органам (Gundersen et al., 2005 г. ).

Височная эпилепсия

Было обнаружено, что РНК-редактируемые высокоаффинные транскрипты α2 и α3 GlyR активируются у пациентов, страдающих височной эпилепсией (Eichler et al., 2008 , 2009 г. ). У тех же пациентов уровень транскрипта ко-транспортера хлорида калия типа 2 (KCC2) был снижен. Чтобы определить, могут ли эти изменения привести к височной эпилепсии, эффекты изменений уровней экспрессии соответствующих транскриптов были исследованы с использованием системы культивирования нейронов.Как и ожидалось, повышающая регуляция GlyR с высоким сродством и подавление KCC2 приводили к деполяризующей тонической активности GlyR, которая шунтировала возбуждающие входы и делала ГАМКергические синапсы возбуждающими. Это, в свою очередь, привело к увеличению соотношения глутаматергических и ГАМКергических синапсов и уменьшению длины дендритов и эксайтотоксичности, что обеспечило возможный механизм повышенной нейровозбудимости, связанной с височной эпилепсией (Eichler et al., 2008). ).

Причина открытия новых модуляторов GlyR

Новые потенцирующие агенты подтипа GlyR необходимы в качестве основных терапевтических соединений при эпилепсии, двигательных расстройствах, хронической воспалительной боли и иммуномодуляции.С другой стороны, антагонисты, специфичные для GlyR с высоким сродством α2 и α3, могут быть полезны в качестве терапевтических средств при височной эпилепсии. Помимо клинических выводов, субъединично-специфические фармакологические пробы также необходимы для установления присутствия и определения роли различных изоформ GlyR в областях центральной нервной системы (например, сетчатке и спинном мозге), которые выражают разнообразие подтипов GlyR. Часто самый простой способ идентифицировать присутствие и физиологическую роль определенного подтипа ионного канала — это использовать специфичный для изоформы ингибитор, чтобы исключить его вклад в сложный набор проводимости, активных в любой момент времени в нейроне.

К сожалению, почти все известные модуляторы GlyR также оказывают сильное влияние на другие типы рецепторов (Lynch, 2009 ), которые ограничивают их применение в качестве зондов для установления физиологической роли различных подтипов GlyR. Важно отметить, что не существует соединений, которые, как известно, усиливают α3 GlyR, но не влияют на α1 GlyR. Таким образом, давно назрела разработка новых фармакологических зондов, специфичных для субъединиц GlyR. На сегодняшний день опубликовано мало исследований, описывающих систематические попытки идентифицировать новые модуляторы, специфичные для подтипа GlyR.Учитывая необычно высокую (> 90%) идентичность аминокислотных последовательностей α1- и α3-субъединиц GlyR в их внеклеточных и трансмембранных рецепторных доменах, уместно рассмотреть возможность обнаружения фармакологических агентов, которые сильно различают эти изоформы. К счастью, есть два указания на то, что в конечном итоге такие лиганды могут быть идентифицированы. Во-первых, используя химеры субъединиц α1 и α3, мы идентифицировали структурно дивергентный трансмембранный сегмент M4 как специфическую детерминанту большой разницы в эффективности агонистов между этими двумя подтипами (Chen et al., 2009b ). Это указывает на то, что экспонированный липидом M4 домен может быть многообещающей областью для связывания подтип-специфичных модуляторов. Во-вторых, анандамид, N -арахидонил-глицин и несколько синтетических агонистов каннабиноидов проявляют различные фармакологические действия на α1 и α3 GlyR (Yang et al., 2008 ). Например, WIN55,212-2 не влияет на α1 GlyR, но сильно ингибирует α3 GlyR. Хотя расположение сайта связывания каннабиноидов еще не известно, эти данные служат хорошим предзнаменованием для существования фармакологически различных модулирующих сайтов на α1 и α3 GlyRs.

Методы открытия новых препаратов с активным GlyR

Автоматизированная электрофизиология патч-зажима

Фиксация патча — это окончательный способ определения функции ионного канала. Он не только предлагает беспрецедентное соотношение сигнал / шум, но также отслеживает влияние соединений в реальном времени. Эта более поздняя особенность позволяет разрешить сложные эффекты соединений (например, быстрое потенцирование с последующим медленным ингибированием). Было успешно реализовано несколько автоматизированных технологий фиксации заплаток (Finkel et al., 2006 г. ; Lepple-Wienhues et al., 2003 г. ; Mathes et al., 2009 г. ; Миллиган и др., 2009 г. ). Хотя технология неуклонно развивается с точки зрения надежности, производительности и стоимости, она все еще ограничена высокой стоимостью и скромной пропускной способностью (Dunlop et al., 2008 ). Таким образом, автоматический патч-зажим, вероятно, лучше всего использовать как средство подтверждения и количественной оценки активности соединений, обнаруженных с помощью флуоресцентных анализов (см. Ниже). Поскольку автоматизированные технологии patch-clip выбирают клетки случайным образом для скрининга, обычно необходимо создавать стабильные клеточные линии, в которых все клетки выражают интересующие ионные каналы, чтобы оптимизировать сбор данных.Создание стабильно экспрессирующейся клеточной линии может быть медленным и кропотливым процессом, особенно когда кто-то заинтересован в скрининге мультимерных рецепторов.

Радиоактивные анализы

Их можно разделить на анализы замещения радиолигандов и анализы потока радиоактивных индикаторов. В случае GlyR анализы замещения радиолигандов включают замещение H-стрихнина 3 немеченым тестируемым соединением (Young and Snyder, 1973 ). У этой технологии есть несколько ограничений. Во-первых, он не предоставляет информации о способе действия (если таковой имеется) соединения.Во-вторых, он может не обнаруживать соединения, которые изменяют функцию рецептора без замещения радиолиганда. Наконец, длительные инкубации с агонистами могут способствовать десенсибилизированному состоянию с другой фармакологией по сравнению с нормальным закрытым или активированным состояниями покоя (Changeux and Edelstein, 1998 ). Анализы потока радиоактивных индикаторов определяют трансмембранный поток радиоактивных анионов, 125 I или 36 Cl (Kardos, 1993 ; Venglarik et al., 1990 ). I обладает высокой проницаемостью через GlyR (Fatima-Shad and Barry, 1993 ).Будучи анализом функции рецептора, а не связывания, этот метод преодолевает некоторые ограничения анализов замещения радиолигандов. В общем, радиоактивные анализы не являются оптимальными для открытия лекарств с высокой пропускной способностью (HT) из-за длительного времени инкубации и множества процессов (например, загрузки индикатора, промывки клеток и этапов лизиса клеток), которые ограничивают HT, высокую стоимость материалов и неудобства, связанные с безопасным обращением и утилизацией радиоактивных материалов.

Колориметрия

Трансмембранный приток I можно измерить по изменению цвета нефлуоресцентного цитоплазматического индикатора (Tang and Wildey, 2004 ).Скорость накопления внутриклеточного I и, следовательно, цвет клеток будет зависеть от степени активации каналов. Поскольку все реакции в конечном итоге перейдут в стационарное состояние независимо от концентрации агониста, необходимо контролировать продолжительность времени, в течение которого реакция может продолжаться. Этот анализ имеет преимущество низкой стоимости и позволяет избежать проблем безопасности и защиты окружающей среды, связанных с радиоактивными материалами. Однако, как и в случае анализа потока радиоактивных индикаторов, его полезность ограничена требованиями к загрузке индикаторов, стадиям отмывки клеток и лизиса.Аналогичный подход, при котором приток Cl осаждает избыток внутриклеточных ионов Ag + , что приводит к изменению цвета (Gill et al., 2006 ), может иметь те же ограничения.

Красители, чувствительные к напряжению (VSD)

На рынке имеется широкий спектр VSD, и выбор, как правило, предполагает компромисс между скоростью отклика и динамическим диапазоном. В приложениях HT-скрининга (HTS) динамический диапазон является основным фактором. Флуоресцентный краситель мембранного потенциала (продается Diagnostic Instruments Inc.) успешно применялся для скрининга соединений против α1 GlyR, стабильно экспрессируемых в клетках HEK293 (Jensen and Kristiansen, 2004 ). В этом исследовании ионные градиенты были установлены таким образом, что активация GlyR вызывала деполяризацию и последующее увеличение флуоресценции. Отклик красителя был относительно медленным, для достижения устойчивого состояния требовалось не менее 30 с, но он предлагал отличный динамический диапазон. Высокая скорость отклика и динамический диапазон могут быть одновременно достигнуты с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).Этот метод включает безызлучательный перенос энергии от флуорофора-донора к флуорофору-акцептору при условии, что спектры излучения донора и спектры поглощения акцептора перекрываются, а соответствующие флуорофоры находятся в непосредственной близости. Когда донор возбуждается на длине волны поглощения, FRET вызывает увеличение флуоресценции акцептора и уменьшение флуоресценции донора. Было показано, что донор CC2-DMPE и акцептор DiBac2 создают устойчивый FRET при отрицательных потенциалах мембраны, когда оба лежат на внешней поверхности мембраны (Gonzalez and Tsien, 1997 ).После деполяризации DiBac2 пересекает мембрану, тем самым увеличивая расстояние от CC2-CPMPE и снижая эффективность FRET. Последующее изменение флуоресценции происходит быстро в большом динамическом диапазоне. Этот метод успешно использовался для скрининга GABA A Rs (Adkins et al., 2001 ) и GluClR (Hamelin et al., 2005 ). В обоих случаях клетки промывали буфером с низким содержанием Cl , так что активация GABA A R вызывала отток Cl , приводящий к деполяризации.Этот метод обеспечивает быструю и чувствительную индикацию активации анионных рецепторов. Однако этот метод дорог, поскольку требует наличия двух экзогенных флуоресцентных индикаторов. Кроме того, поскольку концентрации соответствующих флуорофоров в плазматической мембране должны быть оптимизированы индивидуально для максимальной эффективности FRET, этот метод может потребовать двух стадий инкубации красителя.

В целом, экзогенно применяемые красители имеют несколько ограничений. Во-первых, они представляют собой значительные текущие расходы, а во-вторых, они требуют загрузки красителя и (иногда) этапов промывки клеток, которые ограничивают HT.В-третьих, что, возможно, наиболее серьезно, липофильные красители поглощаются всеми клетками, независимо от того, экспрессируют они интересующий ионный канал или нет. Если, например, только половина клеток выражает интересующий ионный канал, то динамический диапазон усредненного отклика флуоресценции уменьшается вдвое. Таким образом, для достижения полного динамического диапазона все клетки должны реагировать на краситель. Это требование означает, что методы, включающие экзогенно применяемые индикаторы, подходят в первую очередь для гомогенных анализов, таких как те, которые включают стабильно экспрессирующие клеточные линии.

Индикатор генетически закодированного аниона

Желтый флуоресцентный белок (YFP), модифицированный вариант зеленого флуоресцентного белка, подавляется небольшими анионами и, таким образом, подходит для сообщения о притоке анионов в клетки. Метод случайного мутагенеза выявил две мутации, I152L и V163S, каждая из которых значительно увеличивала чувствительность к аниону YFP (Galietta et al., 2001a ). Мутация I152L придает особенно высокую чувствительность к тушению I ( K i ∼ 3 мМ).YFP-I152L оказался полезным при скрининге соединений против анион-проводящего трансмембранного регулятора кистозного фиброза (Galietta et al., 2001b ; Ян и др., 2003 г. ). Он также был применен к GlyR и GABA A R (Kruger et al., 2005 ). Этот анализ имеет несколько преимуществ перед анализом VSD. Во-первых, хотя оба анализа имеют схожие отношения сигнал / шум и динамические диапазоны, анализ YFP быстрее, по крайней мере, в три раза в достижении заданного процентного изменения флуоресценции (Jensen and Kristiansen, 2004 ; Крюгер и др., 2005 г. ). Во-вторых, как вещество для размножения кДНК YFP дешевле. В-третьих, одновременная трансфекция кДНК YFP и ионных каналов в отдельных плазмидных векторах приводит к высокой скорости временной коэкспрессии YFP и функциональных рекомбинантных каналов (Kruger et al., 2005 ). Таким образом, анализ на основе YFP ​​не требует стабильной экспрессии клеточных линий для достижения своего полного динамического диапазона. Наконец, как генетически кодируемый зонд, YFP также подходит для скрининга гетерогенных популяций изолированных нейронов, где YFP ​​трансгенно экспрессируется в определенной подгруппе клеток.Если используется система обнаружения на основе изображений, этот анализ также может быть подходящим для скрининга «высокого содержания» (т. Е. Корреляции нескольких переменных в одной и той же ячейке). В качестве примера этого мы недавно продемонстрировали возможность одновременного скрининга одного соединения против множества подтипов рецепторов GlyR с помощью анализа YFP с использованием проницаемых для клеток красителей для предоставления клеткам, экспрессирующим данный рецептор, уникального оптического идентификатора (Gilbert et al. , 2009c ). Хотя генетически закодированные флуоресцентные детекторы мембранного потенциала постоянно совершенствуются, на этой стадии их изменения флуоресценции, вызванные максимальным напряжением, обычно наблюдаются Baker et al., 2008 г. ; Перрон и др., 2009 г. ). Этот узкий динамический диапазон может быть слишком мал, чтобы давать надежные показания во время HTS, и может объяснить, почему эти датчики еще не нашли широкого применения в качестве инструментов для поиска лекарств.

Открытие препаратов GlyR в нашей лаборатории

Первичный скрининг на основе YFP ​​

Наша лаборатория использует YFP для первичной HTS больших библиотек соединений или фракций натуральных продуктов. Для этой цели мы сконструировали специально созданного робота, состоящего из инвертированного флуоресцентного микроскопа, автоматизированного предметного столика, автосэмплера для работы с жидкостями и цифровой камеры под управлением программ Labview (National Instruments Corp, Остин, Техас, США).Компоненты этого устройства были подробно описаны ранее (Kruger et al., 2005 ). Эксперименты проводятся на прикрепленных клетках HEK293 в 384-луночных планшетах. Автосэмплер может подавать до трех различных растворов (с удалением предыдущего раствора или без него) из разных источников в одну лунку, что обеспечивает широкий спектр вариантов работы с жидкостью. Хотя многократная замена раствора в отдельных лунках полезна для разработки анализа, мы избегаем этого для HTS, так как это слишком сильно замедляет процесс скрининга.ПЗС-матрица захватывает изображения, подобные тем, что показаны на Рисунке 1. A и анализ изображений автоматизирован с использованием специализированного программного обеспечения DetecTiff (Gilbert et al., 2009b ). Технологии скрининга VSD и YFP также успешно используются с коммерческими флуоресцентными ридерами планшетов (Jensen and Kristiansen, 2004 ; Крюгер и др., 2005 г. ).

Рис. 1. Скрининг GlyR с помощью YFP -I152L. (A) Изображения в верхнем ряду были записаны в контрольном растворе NaCl, тогда как изображения в нижнем ряду были записаны из тех же лунок через 8 с после замены только NaI (левое изображение) или NaI + 1 мМ глицина (правое изображение) . (B) Распределение флуоресценции клеток для экспериментов, показанных в (A) . «% Изменения флуоресценции» определяется в тексте. (C) Доза-ответ глицина, выявленная по изменению флуоресценции YFP. Каждая зеленая гистограмма представляет собой общее количество отображаемых флуоресцентных клеток в одной лунке 384-луночного планшета. Синие гистограммы представляют количество клеток на лунку, которые погасли более чем на 20% при добавлении глицина. Слева направо, концентрации глицина были (в мкМ): 0, 3, 10, 15, 30, 50, 100, 300, 1000, 3000.Каждый был применен к двум лункам, и отображается каждое второе значение. (D) Среднее процентное изменение флуоресценции всех флуоресцентных клеток в (C) в зависимости от концентрации глицина. Установлено EC 50 = 22 мкМ. (E) «Тепловая карта» фактического скринингового эксперимента, включающая восемь рядов 384-луночного планшета, с «попаданиями» (то есть фракциями, вызывающими антагонистическую активность), заключенными в рамки и помеченными. Схема эксперимента описана в тексте.

Чтобы подготовить клетки к экспериментам, мы одновременно трансфицируем клетки HEK293 кДНК для YFP-I152L плюс интересующий клон GlyR.Недавно мы опубликовали подробное сравнение пяти методов временной трансфекции, которые обычно используются в лаборатории для этой цели (Gilbert et al., 2009a). ). После завершения трансфекции и удаления реагента для трансфекции около 2000 клеток, суспендированных в 40 мкл культуральной среды, помещают в каждую лунку 384-луночного планшета. Затем планшеты возвращают в инкубатор и через 24–72 часа используют для экспериментов. В зависимости от доли флуоресцентных клеток эффективность трансфекции колеблется от 10 до 50%.Поскольку отображаются только те клетки, которые находятся рядом с центром лунки, мы обычно ограничиваемся анализом 100–500 флуоресцентных клеток на лунку (всего около 1000 клеток на изображение). Как отмечалось выше, мы обычно достигаем отличной корреляции между клетками, экспрессирующими YFP, и клетками, экспрессирующими GlyR. Примеры изображений клеток, экспрессирующих YFP-I152L и α1 GlyR, показаны на рисунке 1. A. Изображенные клетки в верхнем и нижнем рядах подвергались воздействию растворов NaCl и NaI соответственно. Изображения в нижних рядах были получены после 8-секундного воздействия либо только NaI (нижняя левая панель), либо NaI плюс 1 мМ глицина (нижняя правая панель).Рисунок 1 B определяет процентное изменение флуоресценции, вызванное добавлением глицина. Процентное изменение флуоресценции определяется как [( F final / F init ) — 1) × 100, где F init и F final — начальные и конечные значения флуоресценции, соответственно. Эксперимент демонстрирует, что анализ YFP обеспечивает надежную индикацию активации GlyR. Чтобы подчеркнуть этот момент, на Рисунке 1 показан образец экрана выходных данных экспериментального анализа для эксперимента «доза-реакция» глицина. С.Зеленые гистограммы указывают количество флуоресцентных клеток в каждой из 24 лунок в одном ряду 384-луночного планшета. Синие столбцы показывают количество клеток, которые показали тушение> 20% в ответ на добавление контрольного NaI плюс глицин в указанных концентрациях. Каждую концентрацию добавляли в две соседние лунки, причем концентрации увеличивались слева направо, как показано на рисунке 1. C. Эта панель показывает, что почти все флуоресцентные клетки проявляют тушение> 20% при насыщающих концентрациях глицина, что подтверждает предыдущие доказательства сильной корреляции между экспрессией YFP и GlyR.Рисунок 1 D показывает альтернативный анализ результатов, представленных на рисунке 1. C, на этот раз построение среднего процентного изменения флуоресценции всех флуоресцентных клеток в зависимости от концентрации глицина. Чтобы продемонстрировать надежность этого анализа, на Рисунке 1 E показывает примерный результат фактического скринингового эксперимента. В этом эксперименте клетки предварительно инкубировали либо без соединения («отрицательный контроль» в лунках 1 и 2), либо с 10 мкМ антагониста стрихнина («положительный контроль» в лунках 23 и 24) или с фракцией натурального продукта с каждой фракцией. посажен в две соседние скважины (скв. 3–22).Контрольное изображение было снято до добавления глицина, а тестовое изображение было снято через 8 с после добавления глицина. Среднее процентное изменение флуоресценции для всех клеток в каждой лунке было рассчитано, как описано выше, и переведено в цвет в соответствии со шкалой, показанной на рисунке 1. E. Таким образом, чем «теплее» цвет, тем выше антагонистическая активность. В этом эксперименте было получено два сильных удара, показанных оранжевым, и более слабое попадание, показанное зеленым. Сначала мы проверяем фракции натурального продукта как антагонисты, поскольку динамический диапазон флуоресцентного ответа антагониста обычно намного больше, чем у потенциаторного ответа.Как только антагонист с высокой аффинностью идентифицирован, мы выделяем и скринируем аналоги этого соединения с помощью автоматизированной электрофизиологии patch-clip для поиска субъединиц-специфичных положительных и отрицательных модуляторов.

Используя этот анализ, мы проверили около 3000 фракций натурального продукта против α1 GlyR, получив 27 активных фракций. Из этих фракций мы идентифицировали по крайней мере четыре семейства соединений с сильными потенцирующими и ингибирующими эффектами, специфичными для субъединиц GlyR. Из активных фракций мы идентифицировали 28 соединений с сильным (наномолярным — низким микромолярным) действием на GlyR следующим образом:

• 12 соединений, которые специфически усиливают α1 GlyRs,

• 1 соединение, которое специфически усиливает α3 GlyRs,

• 2 соединения, которые усиливают как α1, так и α3 GlyRs,

• 1 соединение, которое специфически ингибирует α1 GlyRs,

• 4 соединения, которые специфически ингибируют α3 GlyRs и

• 8 соединений, которые ингибируют как α1, так и α3 GlyR.

Создание стабильно экспрессирующих клеточных линий HEK293

Поскольку для автоматизированной электрофизиологии патч-зажима требуются стабильные клеточные линии, экспрессирующие интересующие каналы, мы создали клеточные линии, которые стабильно экспрессируют либо α1, либо α3 GlyRs. С этой целью кДНК субъединиц α1 и α3 GlyR человека клонировали в плазмидный вектор pcDNA3.1. После трансфекции линеаризованной векторной ДНК клетки HEK293 поддерживали в течение 14–21 дней в селективной среде, содержащей 1 мг / мл селективного антибиотика G-418 и 10 мкМ стрихнина.Стрихнин был необходим для предотвращения активации GlyR глицином в культуральной среде. Выжившие клетки обрабатывали трипсином, подсчитывали и разбавляли, чтобы получить суспензию, которую использовали для внесения (в среднем) одного индивидуального клона в каждую лунку нескольких 96-луночных планшетов. Затем отдельные клоны выращивали в той же селективной среде в течение примерно 2 недель. Все лунки, идентифицированные как содержащие моноклональные колонии, проверяли на функциональный ответ на 1 мМ глицин с использованием анализа YFP. В этом скрининге были идентифицированы несколько клонов клеток, трансфицированных либо α1-, либо α3-субъединицами GlyR, проявляющими значительный ответ на воздействие глицина, и затем процесс отбора, описанный выше, был повторен с использованием этих клонов.Наконец, после дальнейшего тестирования клетки были последовательно разделены на 24-луночные планшеты, 6-луночные планшеты, 6-см чашки и колбы T75. Все оставшиеся клоны замораживали при -80 ° C для дальнейшего использования. Затем отбирали клоны каждой субъединицы для дальнейшей характеристики в тестах patch-clip и YFP.

Автоматизированная электрофизиология патч-зажима

Эти записи были выполнены с использованием автоматического планарного устройства фиксации чипа Nanion Patchliner (NPC-16A, Nanion Technologies GmBH, Мюнхен, Германия).В этом устройстве используются одноразовые плоские стеклянные «чипы», каждая из которых представляет собой стеклянную пластину с 16 отверстиями, встроенную в микрофлюидную систему из плексигласа, которая направляет растворы на внутреннюю и внешнюю стороны каждого отверстия. Крошечный объем этой микрофлюидной системы является основным преимуществом этой системы, поскольку он позволяет проводить эксперименты с чрезвычайно небольшими количествами соединений. Например, внешний раствор, омывающий клетки, можно полностью заменить, используя 25 мкл нового раствора.Хотя чипы позволяют записывать 16 отдельных ячеек, одновременно можно делать только восемь. Первым шагом в формировании конфигурации целых клеток является введение суспензии стабильно экспрессирующих клеток в микрофлюидную систему, тем самым помещая их на поверхность внешней апертуры. Затем путем приложения отрицательного давления к противоположной стороне отверстия одна ячейка случайным образом прикрепляется к отверстию. В отличие от классической техники патч-кламп, к апертуре перемещается кювета, а не пипетка.Как и в случае с обычным патч-зажимом, герметизация достигается путем всасывания в автоматическом режиме, а затем мембрана разрывается для доступа ко всей клетке. Результатом является электрический путь с низким сопротивлением внутрь клетки, позволяющий записывать патч-зажим целой клетки. Полные экспериментальные детали этих стандартизированных процедур, включая составы внутренних и внешних растворов, представлены в недавних обзорах (Bruggemann et al., 2008 ; Фарре и др., 2009 г. ; Миллиган и др., 2009 г. ). Образцы зависимостей доза-ответ глицина от клеток HEK293, стабильно экспрессирующих либо α1, либо α3 GlyR, записанные с помощью устройства с плоским чипом, показаны на рисунке 2. . Текущие записи сопоставимы по качеству с теми, которые были получены с помощью обычного патч-зажима, а значения глицина EC 50 , полученные с помощью устройства с плоским чипом, сопоставимы с записанными в нашей лаборатории с использованием традиционной электрофизиологии (рис. , легенда). Это говорит о том, что как стабильно экспрессирующие клеточные линии, разработанные в нашей лаборатории, так и планарная система записи чипа подходят для количественной оценки чувствительности α1 и α3 GlyR к интересующим соединениям.Действительно, мы использовали это устройство для создания усредненных зависимостей доза-ответ для всего 36 представляющих интерес соединений на α1 и α3 GlyRs, каждое из которых усреднялось от 3 до 8 клеток. В целом согласуется с предыдущим исследованием (Миллиган и др., 2009 г.) ), мы обычно наблюдаем успешную регистрацию целых клеток, составляющую около 80% всех клеток, засосанных в апертуру, при этом около 50% записей продолжаются в течение 10 минут или более. Рис. 2. Планарные данные патч-клампа для целых клеток из клеток HEK293, стабильно экспрессирующих α1 или α3 GlyR. (A) Текущие ответы в клетках, экспрессирующих α1 и α3 GlyR. Указанные концентрации глицина применялись в течение 2 с с интервалами в 1 мин. (B) Усредненная доза-реакция глицина, усредненная для пяти клеток, экспрессирующих либо α1 (закрашенные символы), либо α3 GlyR (незаполненные символы). Планки погрешностей представляют собой стандартные ошибки, а кривые — соответствие уравнения Хилла усредненным данным. Индивидуальные кривые доза-ответ α1 GlyR были подогнаны под среднюю концентрацию глицина 24 ± 2 мкМ и коэффициент Хилла, равный 1.9 ± 0,2 ( n = 5 клеток). Оба значения существенно не отличались от их соответствующих средних значений (30 ± 1 мкМ и 1,7 ± 0,2, n = 5), зарегистрированных обычным патч-зажимом клеток HEK293, временно экспрессирующих α1 GlyR (Chen et al., 2009a). ). Доза-ответы α3 GlyR соответствовали средней концентрации глицина 166 ± 9 мкМ и коэффициенту Хилла 1,4 ± 0,1 ( n = 5 клеток). Напротив, соответствующие средние значения для α3 GlyR, зарегистрированные с помощью заплатки-зажим временно трансфицированных клеток HEK293, составляли 309 ± 20 мкМ и 2.0 ± 0,1 ( n = 5) (Chen et al., 2009a ).

Открытие новых сайтов связывания препаратов GlyR путем скрининга библиотек случайных мутантов

Создание и проверка библиотеки случайных мутантов GlyR

Не всегда возможно идентифицировать новые сайты связывания лекарств с помощью сайт-направленного мутагенеза. Например, в GlyR еще не доказано, что можно идентифицировать сайт связывания неглицинэргического агониста ивермектина. Мы заинтересованы в идентификации его сайта связывания, потому что (1) он обычно используется в качестве антипаразитарного средства в сельском хозяйстве, ветеринарии и медицине (Omura, 2008). ) и (2) он активирует GlyR по механизму, отличному от глицинергических агонистов (Pless et al., 2007 г. ) и, таким образом, может оказаться полезным инструментом для исследования механизмов активации GlyR. Одним из способов обнаружения этого и других трудноизлечимых сайтов связывания является использование методов HT для скрининга интересующего лекарственного средства против большой библиотеки случайно мутировавших GlyR. Методы случайного мутагенеза обычно включают подверженную ошибкам ПЦР, и был разработан ряд стратегий для реализации этого подхода (An et al., 2008 ; Эмонд и др., 2008 г. ; Fujii et al., 2006 г. ). Подход, который мы использовали, заключался в создании библиотеки случайно мутировавших α1 GlyR-pcDNA 3.1 с использованием набора для произвольного мутагенеза GeneMorph II (Stratagene). Следуя инструкциям производителя, условия реакции фрагментной ПЦР были оптимизированы (750 нг матрицы и 30 циклов ПЦР), чтобы получить частоту мутаций от одной до двух мутаций на 1000 пар оснований (было секвенировано 15-20 клонов из каждой реакции ПЦР, охватывая более 10000 п.н.). Наблюдаемые мутационные спектры, которые очень напоминали предсказанные для мутазима II, соответствовали одному-трем аминокислотным изменениям на рецептор.Наблюдаемые аминокислотные изменения были разбросаны по всей кодирующей последовательности без признаков кластеризации. Примерно 20–25% секвенированных клонов не содержали мутаций. Подобная частота мутаций была успешно использована в аналогичном скрининге канала TRPM8 (Bandell et al., 2006 ). Поскольку это считалось подходящей скоростью мутации, мы затем использовали коммерческую службу (Австралийский исследовательский центр генома, Брисбен, QLD, Австралия) для выращивания 1536 клонов, полученных в результате той же реакции ПЦР, в 384-луночном формате, а затем извлекли плазмидную ДНК достаточного качества. .Также был приготовлен запас глицерина для каждого клона. Этот процесс привел к среднему выходу около 100 нг плазмидной ДНК на клон. Поскольку все известные нам процедуры трансфекции используют не менее 100 нг плазмидной ДНК независимо от количества клеток или объема культуральной среды, необходимо было разработать метод надежной трансфекции гораздо меньших количеств плазмидной ДНК в отдельные лунки 384-луночного планшета. . Этот метод представлен в дополнительном материале. Вкратце, мы уменьшили стандартную процедуру трансфекции фосфатом кальция и протестировали ее эффективность трансфекции с различными количествами плазмидной ДНК YFP.Как показано на рисунке 3 было обнаружено, что эффективность трансфекции YFP была максимальной при 10 нг плазмидной ДНК на лунку.

Рис. 3. Экспрессия желтого флуоресцентного белка в клетках, трансфицированных в отдельных лунках 384-луночного планшета, в зависимости от количества трансфицированной кДНК. (A) Пример результатов одного эксперимента. Все лунки содержали эквивалентное количество (~ 5000) клеток. (B) Среднее количество флуоресцентных клеток на изображение, среднее из четырех независимых экспериментов.Стрелка обозначает точку оптимальной эффективности трансфекции.

В поисках мутаций, влияющих на чувствительность к ивермектину, мы сначала добавили NaI, содержащий 30 нМ ивермектина, в каждую лунку. После этого наносили 10 мкМ ивермектина, а затем 1 мкМ глицина. Обоснованием этого подхода было то, что 30 нМ ивермектина является подпороговым для α1 GlyR дикого типа (WT), тогда как 10 мкМ едва насыщает (Shan et al., 2001 ). Таким образом, количественная оценка вариаций в ответах рецепторов на обе эти концентрации должна позволить обнаруживать мутации, которые существенно увеличивают или снижают чувствительность к ивермектину.Последнее нанесение насыщающего глицина служило контролем для определения функциональной экспрессии GlyR в том случае, если мутация полностью устраняла чувствительность к ивермектину.

Пример результатов скрининга случайных мутантов

После первого раунда скрининга в общей сложности 1566 клонов (1536 случайных мутантов плюс 30 сайт-направленных мутантов, ранее созданных в лаборатории), мы идентифицировали 44 мутантных клона, которые значительно изменили чувствительность к ивермектину. Эффекты 20 из этих клонов были подтверждены вторым раундом скрининга на основе флуоресценции.Из этого пула клонов с помощью нуклеотидного секвенирования и электрофизиологии мы подтвердили в общей сложности четыре мутации α1 GlyR, которые значительно изменяют чувствительность к ивермектину. Одной из мутаций, идентифицированных с помощью этого процесса, была высококонсервативная замена Y279F во внеклеточном линкерном домене M2-M3. Примеры токов, активируемых указанными концентрациями ивермектина и глицина в GlyR α1 мутанта WT и Y279F, показаны на рисунке 4. A. Усредненные зависимости реакции от дозы ивермектина для обоих рецепторов с величинами тока, нормализованными к тем, которые активируются глицином в той же клетке, представлены на рисунке 4. Б.Усредненная доза-реакция на ивермектин для мутантного Y279C GlyR также указывает на специфичность замены Y-F в нарушении чувствительности к ивермектину. Поскольку эта замена включает просто удаление гидроксильной группы, мы предполагаем, что Y279 специфически участвует в механизме связывания или стробирования ивермектина. В настоящее время проводятся эксперименты по выяснению молекулярной основы этого эффекта. Мы ожидаем, что эти эксперименты могут дать важную информацию о сайте связывания или механизме действия этого важного фармацевтического агента.

Рис. 4. Мутация Y279F резко снижает чувствительность α1 GlyR к ивермектину. (A) Обычные записи целых клеток с помощью патч-клампа из клеток HEK293, временно экспрессирующих немутантные или мутантные Y279F α1 GlyR (верхняя и нижняя панели, соответственно). Были нанесены указанные концентрации глицина и ивермектина, как показано незаполненными и закрашенными полосками, соответственно. Поскольку активация ивермектина необратима, доза-ответ был получен путем последовательного применения увеличивающихся концентраций ивермектина. (B) Усредненные дозозависимые реакции ивермектина, каждая из которых усреднена для пяти клеток, экспрессирующих либо GlyRs дикого типа α1 (закрашенные кружки), мутантные α1 GlyRs Y279C (незаполненные кружки) или мутантные α1 GlyRs Y279F (треугольники). Планки погрешностей представляют собой стандартные ошибки среднего, а кривые соответствуют усредненным данным с помощью уравнения Хилла. Мутация Y в F вызывает примерно 50-кратное снижение чувствительности к ивермектину.

Несмотря на то, что GlyR становятся потенциальными мишенями для лечения двигательных расстройств, хронической воспалительной боли, височной эпилепсии и иммуномодуляции, мы не знаем о каких-либо систематических опубликованных попытках открыть новые лекарственные средства, активные в отношении этих рецепторов.Первой целью этого обзора было рассмотрение различных HTS-поддающихся лечению методов, которые могут быть применимы к этим рецепторам. Мы пришли к выводу, что анион-чувствительный YFP является оптимальным методом для первого раунда скрининга и что автоматизированная электрофизиология клеток, стабильно экспрессирующих GlyR, является полезным средством подтверждения активности и количественной оценки действий идентифицированных соединений. Вторая цель этого обзора состояла в том, чтобы продемонстрировать, как эти методы используются на практике в нашей лаборатории с целью открытия новых GlyR-активных соединений и установления механизмов их действия.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Этот проект был поддержан Австралийским исследовательским советом и Национальным советом Австралии по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC). J.W. Линча поддерживает старший научный сотрудник NHMRC.

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу http: // www.frontiersin.org/molecularneuroscience/paper/10.3389/neuro.02/017.2009/ Адкинс, К. Э., Пиллаи, Г. В., Керби, Дж., Боннер, Т. П., Халдон, К., МакКернан, Р. М., Гонсалес, Дж. Э., Оадес, К., Уайтинг, П. Дж., И Симпсон, П. Б. (2001). alpha4beta3delta GABA (A) рецепторы, характеризующиеся измерениями мембранного потенциала на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии. J. Biol. Chem. 276, 38934–38939. Ахмади С., Липпросс С., Нойхубер В. Л. и Цайльхофер Х. У. (2002). PGE (2) избирательно блокирует ингибирующую глицинергическую нейротрансмиссию на нейроны поверхностного дорсального рога крысы. Нат. Neurosci. 5, 34–40. Ань, Й., Цзи, Дж., Ву, В., Хуанг, Р., Вэй, Й., и Сю, З. (2008). Случайный мутагенез и рекомбинация гена sam1 путем интеграции подверженной ошибкам ПЦР с процессом ступенчатого удлинения. Biotechnol. Lett. 30, 1227–1232. Бейкер, Б.Дж., Муто, Х., Димитров, Д., Акеман, В., Перрон, А., Ивамото, Ю., Джин, Л., Коэн, Л.Б., Исакофф, Е.Ю., Пиерибоне, В.А., Хьюз, Т. и Кнопфель Т. (2008). Генетически закодированные флуоресцентные сенсоры мембранного потенциала. Brain Cell Biol. 36, 53–67. Баккер М. Дж., Ван Дейк Дж. Г., ван ден Маагденберг А. М. и Тейссен М. А. (2006). Синдромы испуга. Lancet Neurol. 5, 513–524. Бальс, Э., Тесье, Л. Х., Форстер, В., Ру, М. Дж., Сахель, Дж. А., и Пико, С. (2006). Рецепторы глицина в популяции колбочек взрослых млекопитающих. J. Physiol. (Лондон) 571, 391–401. Bandell, M., Dubin, A. E., Petrus, M. J., Orth, A., Mathur, J., Hwang, S. W., and Patapoutian, A. (2006).Высокопроизводительный случайный скрининг мутагенеза выявляет остатки TRPM8, специфически необходимые для активации ментолом. Нат. Neurosci. 9, 493–500. Бец, Х., и Лаубе, Б. (2006). Рецепторы глицина: недавнее понимание их структурной организации и функционального разнообразия. J. Neurochem. 97, 1600–1610. Брюггеманн А., Фарре К., Хаарманн К., Хэйторнтвейт А., Крейр М., Стулзле С., Джордж М. и Фертиг Н. (2008). Планарный патч-зажим: достижения электрофизиологии. Methods Mol. Биол. 491, 165–176. Каспари Д. М., Линг Л., Тернер Дж. Г. и Хьюз Л. Ф. (2008). Тормозная нейротрансмиссия, пластичность и старение в центральной слуховой системе млекопитающих. J. Exp. Биол. 211, 1781–1791. Чанжакс, Дж. П., и Эдельштейн, С. Дж. (1998). Аллостерические рецепторы после 30 лет. Нейрон 21, 959–980. Чен, X., Кромер, Б., Уэбб, Т. И., Янг, З., Хантке, Дж., Харви, Р. Дж., Паркер, М. У., и Линч, Дж. У. (2009a). Ингибирование рецептора глицина дигидропиридином: субъединичная селективность и молекулярная детерминанта ингибирования. Нейрофармакология 56, 318–327. Чен, X., Уэбб, Т. И., и Линч, Дж. У. (2009b). Трансмембранный сегмент M4 вносит вклад в различия в агонистической эффективности глициновых рецепторов альфа1 и альфа3. Мол. Membr. Биол. 1–12. Данлоп Дж., Боулби М., Пери Р., Васильев Д. и Ариас Р. (2008). Электрофизиология с высокой пропускной способностью: новая парадигма для скрининга ионных каналов и физиологии. Нат. Rev. Drug Discov. 7, 358–368. Эйхлер, С.А., Форстера, Б., Смолинский Б., Юттнер Р., Леманн Т. Н., Фалинг М., Шварц Г., Лежандр П. и Мейер Дж. К. (2009). Сплайс-специфические роли рецептора глицина альфа3 в гиппокампе. Eur. J. Neurosci. (в печати). Эйхлер, С.А., Кирищук, С., Юттнер, Р., Шафермайер, П.К., Лежандр, П., Леманн, Т.Н., Гловели, Т., Грантин, Р., и Мейер, Дж. К. (2008). Глицинергическое тоническое ингибирование нейронов гиппокампа с деполяризующей ГАМКергической передачей вызывает гистопатологические признаки височной эпилепсии. J. Cell Mol. Med. 12, 2848–2866. Эмонд, С., Мондон, П., Пиццут-Серин, С., Дучи, Л., Крозе, Ф., Буаяди, К., Харрат, Х., Потоцки-Веронезе, Г., Монсан, П., и Ремо-Симеон, М. (2008). Новый подход случайного мутагенеза с использованием мутагенных ДНК-полимераз человека для создания библиотек вариантов ферментов. Protein Eng. Des. Sel. 21, 267–274. Фарре, К., Хэйторнтвейт, А., Хаарманн, К., Стулзле, С., Крейр, М., Джордж, М., Брюггеманн, А., и Фертиг, Н. (2009). Port-a patch и patchliner: электрофизиология высокой точности для вторичного скрининга и фармакологии безопасности. Расческа. Chem. Экран с высокой пропускной способностью. 12, 24–37. Фатима-Шад, К., и Барри, П. Х. (1993). Проникновение анионов в GABA- и глицин-управляемые каналы культивируемых нейронов гиппокампа млекопитающих. Proc. Биол. Sci. 253, 69–75. Финкель, А., Виттель, А., Янг, Н., Хандран, С., Хьюз, Дж., И Константин, Дж. (2006). Патч-клещ для популяции улучшает согласованность данных и повышает успешность измерения ионных токов. J Экран Biomol. 11, 488–496. Флинт, А.С., Лю, X.и Кригштейн А. Р. (1998). Активация несинаптических рецепторов глицина на раннем этапе развития неокортекса. Нейрон 20, 43–53. Фро, М., Турман, Р. Г., и Уилер, М. Д. (2002). Молекулярные доказательства наличия хлоридного канала, управляемого глицином, в макрофагах и лейкоцитах. Am. J. Physiol. Гастроинтест. Liver Physiol. 283, G856 – G863. Фудзи Р., Китаока М. и Хаяси К. (2006). Подверженная ошибкам амплификация по методу катящегося круга: простейший протокол случайного мутагенеза. Nat Protoc 1, 2493–2497.Галиетта, Л. Дж., Хагги, П. М., и Веркман, А. С. (2001a). Зеленые флуоресцентные галогенидные индикаторы на белковой основе с улучшенным сродством к хлоридам и йодидам. FEBS Lett. 499, 220–224. Галиетта, Л. В., Джаяраман, С., и Веркман, А. С. (2001b). Клеточный анализ для высокопроизводительного количественного скрининга агонистов транспорта хлорида CFTR. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 281, C1734 – C1742. Ге, Л. Х., Ли, С. К., Лю, Дж., И Янг, X. Л. (2007). Рецепторы глицина функционально экспрессируются на фоторецепторах колбочек сетчатки лягушки. Неврология 146, 427–434. Гилберт Д. Ф., Эсмаили А. и Линч Дж. У. (2009a). Оптимизация экспрессии рекомбинантных рецепторов GABAA алфавита в клетках HEK293 для высокопроизводительного скрининга. J. Biomol. Экран. 14, 86–91. Гилберт, Д. Ф., Майнхоф, Т., Пепперкок, Р., и Рунц, Х. (2009b). DetecTiff (C): новая программа анализа изображений для скрининговой микроскопии с высоким содержанием. J. Biomol. Экран. Гилберт, Д. Ф., Уилсон, Дж. К., Нинк, В., Линч, Дж.У. и Осборн Г. У. (2009c). Мультиплексное мечение жизнеспособных клеток для высокопроизводительного анализа функции рецептора глицина с использованием проточной цитометрии. Cytometry A 75, 440–449. Гилл, С., Гилл, Р., Се, Ю., Уикс, Д., и Лян, Д. (2006). Разработка и валидация анализа потока HTS для эндогенно экспрессируемых хлоридных каналов в клеточной линии CHO-K1. Assay Drug Dev. Technol. 4, 65–71. Гонсалес, Дж. Э., и Цзянь, Р. Ю. (1997). Улучшенные индикаторы потенциала клеточной мембраны, использующие резонансный перенос энергии флуоресценции. Chem. Биол. 4, 269–277. Grudzinska, J., Schemm, R., Haeger, S., Nicke, A., Schmalzing, G., Betz, H., and Laube, B. (2005). Бета-субъединица определяет лиганд-связывающие свойства синаптических глициновых рецепторов. Нейрон 45, 727–739. Грюнерт, У., и Гош, К. К. (1999). Клетки карликовых и паразольных ганглиев сетчатки приматов экспрессируют субъединицу альфа1 рецептора глицина. Vis. Neurosci. 16, 957–966. Грюнерт У. и Вассл Х. (1993). Иммуноцитохимическая локализация рецепторов глицина в сетчатке млекопитающих. J. Comp. Neurol. 335, 523–537. Гундерсен, Р. Ю., Ваагенес, П., Брейвик, Т., Фоннум, Ф., и Опстад, П. К. (2005). Глицин — важный нейромедиатор и цитопротектор. Acta Anaesthesiol. Сканд. 49, 1108–1116. Хамелин, М., Мэн, X., Кадди, М., Корсун, К., Ондейка, Дж., Симпсон, П. Б., Калли, Д. Ф., и Прист, Б. Т. (2005). Высокопроизводительный анализ модуляторов лиганд-управляемых хлоридных каналов. Assay Drug Dev. Technol. 3, 59–64. Харви, Р.Дж., Депнер, У. Б., Вассл, Х., Ахмади, С., Хайндл, К., Рейнольд, Х., Смарт, Т. Г., Харви, К., Шутц, Б., Або-Салем, О. М., Циммер, А. ., Пуазбо, П., Велцль, Х., Вольфер, Д.П., Бец, Х., Цайльхофер, Х.У., и Мюллер, У. (2004). GlyR alpha3: важная мишень для сенсибилизации боли, опосредованной PGE2 в позвоночнике. Наука 304, 884–887. Хаверкамп С., Мюллер У., Харви К., Харви Р. Дж., Бец Х. и Вассл Х. (2003). Разнообразие рецепторов глицина в сетчатке мышей: локализация субъединицы альфа3. J. Comp. Neurol. 465, 524–539. Хаверкамп С., Мюллер У., Цайльхофер Х. У., Харви Р. Дж. И Вассл Х. (2004). Разнообразие рецепторов глицина в сетчатке мышей: локализация субъединицы альфа2. J. Comp. Neurol. 477, 399–411. Хильф, Р. Дж., И Дутцлер, Р. (2008). Рентгеновская структура прокариотического ионного канала, управляемого пентамерным лигандом. Природа 452, 375–379. Икедзима, К., Ку, В., Стахлевиц, Р. Ф., и Турман, Р. Г. (1997). Клетки Купфера содержат хлоридный канал, управляемый глицином. Am. J. Physiol. 272, G1581 – G1586. Йенсен, А.А., Кристиансен, У. (2004). Функциональная характеристика человеческого альфа1-глицинового рецептора в анализе мембранного потенциала на основе флуоресценции. Biochem. Pharmacol. 67, 1789–1799. Юсуф П. Р., Хаверкамп С. и Грюнерт У. (2005). Локализация альфа-субъединиц глицинового рецептора на биполярных и амакриновых клетках сетчатки приматов. J. Comp. Neurol. 488, 113–128. Кандлер, К. (2004). Активно-зависимая организация тормозных контуров: уроки слуховой системы. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 96–104. Кардос, Дж. (1993). Канал рецептора GABAA опосредует транслокацию хлорид-иона через плазматическую мембрану: новые выводы из измерений потока ионов 36Cl. Synapse 13, 74–93. Крюгер, В., Гилберт, Д., Хоторн, Р., Хрицив, Д. Х., Фрингс, С., Поронник, П., и Линч, Дж. У. (2005). Анализ на основе желтого флуоресцентного белка для высокопроизводительного скрининга каналов хлорида глицина и ГАМК-рецептора. Neurosci. Lett. 380, 340–345.Lepple-Wienhues, A., Ferlinz, K., Seeger, A., and Schafer, A. (2003). Подсказка: автоматизированный, высококачественный, экономичный экран с зажимом для заплат. Рецепт. Каналы 9, 13–17. Линч, Дж. У. (2009). Подтипы собственных рецепторов глицина и их физиологические роли. Нейрофармакология 56, 303–309. Линч, Дж. У., и Каллистер, Р. Дж. (2006). Рецепторы глицина: новая терапевтическая мишень в болевых путях. Curr. Opin. Расследование. Наркотики 7, 48–53. Маджумдар, С., Хайнце, Л., Хаверкамп, С., Иванова, Э., Вассл, Х. (2007). Глициновые рецепторы ганглиозных клеток А-типа сетчатки мыши. Vis. Neurosci. 24, 471–487. Малозио, М. Л., Маркез-Пуэй, Б., Кузе, Дж., И Бец, Х. (1991). Широко распространенная экспрессия мРНК субъединицы глицинового рецептора в мозге взрослых и развивающихся крыс. EMBO J. 10, 2401–2409. Матес, К., Фриис, С., Финли, М., и Лю, Ю. (2009). QPatch: недостающее звено между HTS и открытием лекарств с ионным каналом. Расческа.Chem. Экран с высокой пропускной способностью. 12, 78–95. МакКул, Б.А., и Фаррони, Дж. С. (2001). Субъединичный состав стрихнин-чувствительных рецепторов глицина, экспрессируемых базолатеральными нейронами миндалины взрослых крыс. Eur. J. Neurosci. 14, 1082–1090. Мейзель, С. (1997). Аминокислотный рецептор нейромедиатора / хлоридные каналы спермы млекопитающих и акросомная реакция. Biol. Репрод. 56, 569–574. Миллиган, К. Дж., Ли, Дж., Сукумар, П., Маджид, Ю., Даллас, М. Л., Инглиш, А., Эмери, П., Портер, К.Э., Смит, А.М., Макфадзин, И., Беккано-Келли, Д., Бахнаси, Ю., Чеонг, А., Нейлор, Дж., Зенг, Ф., Лю, X., Гампер, Н. , Jiang, LH, Pearson, HA, Peers, C., Robertson, B., and Beech, DJ (2009). Роботизированный многолуночный планарный патч-зажим для нативных и первичных клеток млекопитающих. Nat Protoc 4, 244–255. Мори М., Гавилер Б. Х. и Гербер У. (2002). Бета-аланин и таурин как эндогенные агонисты рецепторов глицина в гиппокампе крыс in vitro. J. Physiol. (Лондон.) 539, 191–200. Омура, С. (2008). Ивермектин: 25 лет и все еще в силе. Внутр. J. Antimicrob. Агенты 31, 91–98. Перрон А., Муто Х., Акеманн В., Гаутам С. Г., Димитров Д., Ивамото Ю. и Кнёпфель Т. (2009). Чувствительные к напряжению флуоресцентные белки второго и третьего поколения для мониторинга мембранного потенциала. Front Mol Neurosci 2, 5. Плесс, С.А., Дибас, М.И., Лестер, Х.А., и Линч, Дж. У. (2007). Конформационная изменчивость домена М2 рецептора глицина в ответ на активацию различными агонистами. J. Biol. Chem. 282, 36057–36067. Рейнольд, Х., Ахмади, С., Депнер, У. Б., Лей, Б., Хайндл, К., Хамза, М., Пал, А., Брун, К., Нарумия, С., Мюллер, У. и Zeilhofer, HU (2005). Воспалительная гипералгезия позвоночника опосредуется рецепторами простагландина E подтипа EP2. J. Clin. Инвестировать. 115, 673–679. Шан, К., Хаддрил, Дж. Л., и Линч, Дж. У. (2001). Ивермектин, нетрадиционный агонист хлоридного канала рецептора глицина. J. Biol. Chem. 276, 12556–12564.Саймон, Дж., Вакимото, Х., Фудзита, Н., Лаланд, М., и Барнард, Э. А. (2004). Анализ набора генов рецепторов ГАМК (А) в геноме человека. J. Biol. Chem. 279, 41422–41435. Танг, В., и Уайлди, М. Дж. (2004). Разработка колориметрического метода анализа функциональных хлоридных каналов. J. Biomol. Экран. 9, 607–613. Анвин, Н. (2003). Структура и действие никотинового рецептора ацетилхолина исследованы с помощью электронной микроскопии. FEBS Lett. 555, 91–95.Венгларик, К. Дж., Бриджес, Р. Дж., И Фриззелл, Р. А. (1990). Простой анализ регулируемой агонистами проводимости Cl и K в секретирующих соли эпителиальных клетках. Am. J. Physiol. 259, C358-364. Веруки, М. Л., Гилл, С. Б., и Хартвейт, Э. (2007). Спонтанные IPSC и глициновые рецепторы с медленной кинетикой в ​​амакриновых клетках широкого поля в сетчатке зрелой крысы. J. Physiol. (Лондон) 581, 203–219. Ватанабэ Э. и Акаги Х. (1995). Паттерны распределения мРНК, кодирующих каналы рецепторов глицина в развивающемся спинном мозге крыс. Neurosci. Res. 23, 377–382. Уилер М., Стахлевиц Р. Ф., Ямашина С., Икедзима К., Морроу А. Л. и Турман Р. Г. (2000). Управляемые глицином хлоридные каналы в нейтрофилах ослабляют приток кальция и выработку супероксида. FASEB J. 14, 476–484. Ян, Х., Шелат, А.А., Гай, Р.К., Гопинатх, В.С., Ма, Т., Ду, К., Лукач, Г.Л., Таддеи, А., Фолли, К., Педемонте, Н., Галиетта, Л.Дж., и Веркман, А.С., (2003). Небольшие молекулы-корректоры с наномолярным сродством дефектного стробирования хлоридных каналов Delta F508-CFTR. J. Biol. Chem. 278, 35079–35085. Янг, З., Обри, К. Р., Алрой, И., Харви, Р. Дж., Ванденберг, Р. Дж., И Линч, Дж. У. (2008). Субъединичная модуляция рецепторов глицина каннабиноидами и N-арахидонил-глицином. Biochem. Pharmacol. 76, 1014–1023. Янг, А. Б., и Снайдер, С. Х. (1973). Связывание стрихнина связано с рецепторами глицина центральной нервной системы. Proc. Natl. Акад. Sci. США 70, 2832–2836. Янг, Т. Л., и Чепко, К.Л. (2004). Роль лиганд-управляемых ионных каналов в развитии палочковых фоторецепторов. Нейрон 41, 867–879. Цайльхофер, Х. У. (2005). Глицинергический контроль обработки боли в позвоночнике. Cell Mol. Life Sci. 62, 2027–2035.

Структура и фармакологическая модуляция ингибирующих глициновых рецепторов

Визуальный обзор

Abstract

Глициновые рецепторы (GlyR) — это ингибирующие ионные каналы Cys-петли, которые способствуют контролю возбудимости вдоль центральной нервной системы (ЦНС).GlyR обнаруживаются в спинном мозге и стволе головного мозга, а совсем недавно о них сообщалось в более высоких областях ЦНС, таких как гиппокамп и прилежащее ядро. GlyR участвуют в координации движений, дыхательных ритмах, передаче боли и сенсорной обработке, и они являются мишенями для соответствующих физиологических и фармакологических модуляторов. Несколько исследований с использованием кристаллографии белков и криоэлектронной микроскопии пролили свет на остатки и механизмы, связанные с активацией, блокадой и регуляцией пентамерных ионных каналов Cys-петли на атомном уровне.Первоначальные исследования, проведенные на внеклеточном домене рецепторов ацетилхолина, ионных каналах от гомологов прокариот — Erwinia chrysanthemi , управляемый лигандом ионный канал (ELIC), Gloeobacter violaceus , управляемый лигандом ионный канал (GLIC) — и кристаллизованные эукариотические рецепторы сделали это возможным. для определения общей структуры и топологии рецепторов Cys-петли. Напр., Определение пентамерных структур GlyR, связанных с глицином и стрихнином, способствовало визуализации структурных изменений, связанных с переходом между открытым и закрытым состояниями рецепторов Cys-петли.В этом обзоре мы суммируем, как новая информация, полученная в функциональных, мутагенезных и структурных исследованиях, способствовала лучшему пониманию функции и регуляции GlyR.

Введение

Ингибирующие глициновые рецепторы (GlyR) представляют собой анион-селективные лиганд-управляемые ионные каналы (LGIC), которые вместе с рецепторами GABA A (GABA A R), рецепторами никотинового ацетилхолина (nAChR) и серотонинового типа 3 рецептора (5HT-3) образуют эукариотическое семейство Cys-петель.В зрелых нейронах активация GlyR приводит к быстрому увеличению пассивной диффузии анионов, в основном ионов хлорида, в нейроны, что приводит к гиперполяризации мембраны и снижению возбудимости нейронов (Lester et al., 2004; Miller and Smart, 2010 ; Zeilhofer et al., 2012). Хорошо известно, что ингибирующая функция GlyR имеет решающее значение для контроля нескольких физиологических процессов, а именно мышечного тонуса, координации движений, обработки сенсорной информации, дыхательных ритмов и боли (Lynch, 2009; Callister and Graham, 2010; Zeilhofer et al., 2012; Альварес и др., 2013). Кроме того, критическая роль ингибирования GlyR в нормальной физиологии дополнительно подчеркивается генетическими исследованиями на людях, которые связывают мутации в генах GlyR с гиперэкплексией (Harvey et al., 2008).

Функциональные проницаемые для хлоридов ионные каналы GlyR образованы 5 субъединицами α (гомомерными) или смесью субъединиц α и β (гетеропентамерные), которые представляют собой молекулярные комплексы с 2 α –3 β или 3 α –2 β стехиометрия (Grudzinska et al., 2005; Durisic et al., 2012). В настоящее время описаны четыре субъединицы α ( α 1–4) и одна субъединица β , которые имеют регионально и временно контролируемую экспрессию во время развития и созревания центральной нервной системы (ЦНС).

Субъединица α 1 широко экспрессируется в ЦНС взрослых, но низкие уровни были обнаружены в спинном мозге на раннем этапе развития и у новорожденных животных с повышенной экспрессией к 15 дню постнатального развития (Aguayo et al., 2004; Линч, 2009). Напротив, α 2 субъединиц демонстрируют высокий уровень экспрессии во время эмбрионального развития в спинном мозге, стволе мозга и некоторых надспинальных областях, таких как кора, гиппокамп и таламус (Kuhse et al., 1991; Malosio et al., 1991). Преобладающая экспрессия α 2 значительно снижается на поздних стадиях развития мозга. Однако было высказано предположение, что экспрессия α 2 поддерживается в более высоких областях мозга, таких как гиппокамп и кора головного мозга (Kuhse et al., 1991; Chau et al., 2010; Авила и др., 2013; Бледнов и др., 2015). α 3 субъединиц экспрессируются после третьей постнатальной недели в гиппокампе, сетчатке и ламине II спинного дорсального рога (Malosio et al., 1991; Aguayo et al., 2004; Harvey et al., 2004). Наконец, субъединица α 4 обнаруживается как псевдоген у людей, но она экспрессируется в спинном мозге, симпатической нервной системе, почках, печени, сперматозоидах и сетчатке других видов (Harvey et al., 2000; Simon et al. al., 2004).

Субъединицы α , но не субъединица β , могут образовывать функциональные гомопентамерные ионные каналы. При наличии в гетеропентамерном α / β GlyR субъединица β проявляет структурные и регуляторные функции, включая кластеризацию GlyR в синаптических местах за счет взаимодействия внутриклеточного петлевого домена (IL) β с каркасным белком гефирином, и контроль фармакологических ответов на агонист и несколько других модуляторов (van Zundert et al., 2005; Calamai et al., 2009; Dutertre et al., 2012). В настоящем обзоре мы определяем термин модулятор для обозначения лиганда (небольшой молекулы или белка), который связывается с сайтом, отличным от сайта агониста, но аллостерически влияет на функцию рассматриваемого белка.

Текущее состояние фармакологии GlyR было рассмотрено ранее в другом месте (Lynch, 2009; Yevenes and Zeilhofer, 2011; Zeilhofer et al., 2012; Burgos et al., 2015b) и состоит из ограниченного набора агонистов, антагонистов, и растущее количество модуляторов.До недавнего времени большая часть наших знаний об отдельных остатках и механизмах, участвующих в функции GlyR и фармакологических модуляциях, была получена из исследований с использованием мутированного GlyR в сочетании с электрофизиологическими исследованиями и молекулярным моделированием с nAChR или прокариотическими рецепторами Cys-петли в качестве матриц (Absalom et al. ., 2003; Bertaccini et al., 2007; Сперанский и др., 2007; Cheng et al., 2008; Harris et al., 2008; Vijayan et al., 2012; Olsen et al., 2014; Yu et al. , 2014). В последние годы, однако, несколько сообщений пролили важный новый свет на остатки и механизмы на атомном уровне, связанные с активацией, блокадой и модуляцией пентамерных ионных каналов Cys-петли.Здесь мы намерены обобщить самые последние достижения в структуре GlyR с особым акцентом на молекулярных сайтах, лежащих в основе его функциональной регуляции с помощью нескольких модуляторов, имеющих физиологическое и клиническое значение.

Общая структура рецепторов Cys-петли

Создание полных атомных структур рецепторов Cys-петли, включая GlyR, до сих пор было очень сложной задачей. Технически все еще существует потребность в оптимизированных системах экспрессии, которые могут продуцировать большие концентрации высокоочищенных белков со зрелыми посттрансляционными модификациями и высокой растворимостью (Carpenter et al., 2008). Основные доступные на сегодняшний день структуры показаны в таблице 1. Данные по ацетилхолин-связывающему белку (AChBP) улитки Lymnaea stagnalis с разрешением 2,7 Å предоставили исходные экспериментально определенные данные для сайта связывания агониста на рецепторе Cys-петли ( Brejc et al., 2001). Позже структура nAChR, полученная с помощью криоэлектронной микроскопии с разрешением 4 Å, предоставила новую информацию об атомной структуре одного из наиболее изученных LGIC, описав как подробную структуру сайта связывания агониста, так и предложив некоторые последовательные события, которые могут привести к открытию канала. (Анвин, 2005).Совсем недавно структуры с высоким разрешением прокариотического ионного канала, управляемого лигандом (LGIC), активированного ГАМК из Erwinia chrysanthemi (ELIC) (Hilf and Dutzler, 2008; Zimmermann and Dutzler, 2011) и протонно-управляемого ионного канала из Gloeobacter violaceus (GLIC) были опубликованы (Prevost et al., 2012; Sauguet et al., 2013b). По сравнению с GlyR анализ показал некоторые различия, вероятно, связанные с функциональностью белков. Во-первых, они показали более низкую идентичность последовательностей 25% ( α 1/ ELIC : 24%; α 1/ GLIC : 23%).Во-вторых, в отличие от GlyR, они обладали катионной селективностью и слабой степенью фармакологической модуляции.

ТАБЛИЦА 1

Экспериментально разрешенные структуры ионных каналов Cys-петли

Краткое изложение основных структур рецепторов прокариотов и эукариот, полученных с помощью дифракции рентгеновских лучей (XRD), электронной криомикроскопии (ECM) или ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в растворе. Кроме того, состояния ионного канала в каждой структуре обозначены — открытые (O), закрытые (C), локально закрытые (LC), состояния покоя (R) или неприменимые (NA) — с соответствующими кодами Protein DataBank. (http: // www.rcsb.org/pdb/home/home.do).

Более значительный вклад в понимание структурных характеристик GlyR был недавно достигнут путем изучения кристаллографической структуры глутамат-управляемых хлоридных каналов (GluCl) из Caenorhabditis elegans , эукариотического LGIC, что позволило моделировать гомологию GlyR, поскольку он представили более высокий процент идентичности ( α 1/ GluCl : 44%) (Hibbs and Gouaux, 2011). Ключевой прогресс в разрешении структуры GlyR был достигнут в результате исследований гомопентамеров, образованных субъединицами α 1 или α 3 и химерным рецептором GLIC / α 1 GlyR, называемым Lily (Du et al., 2015; Хуанг и др., 2015; Moraga-Cid et al., 2015). Все эти недавние исследования внесли свой вклад в понимание природы конформационных изменений, которые могут происходить во время открытых-закрытых состояний, десенсибилизации и фармакологической модуляции.

Разрешение структур GlyR подтвердило классическую топологию семейства Cys-петель, которое включает большой внеклеточный N-концевой домен (ECD), четыре трансмембранных домена (TM1-4), большую IL между TM3 и TM4 и небольшой внеклеточный С-концевой участок (Moss and Smart, 2001; Thompson et al., 2010) (рис. 1А). Эти белковые структуры также подтверждают конформацию функциональных комплексов пентамерных ионных каналов с доменами TM2, формирующими поры ионных каналов на центральной оси, а домены TM4 обращены к плазматической мембране (Fig. 1B).

Рис. 1.

Топология и схематическая структура GlyR. (A) Представление мономера α 1 GlyR, где представлены различные области рецептора: внеклеточный домен (ECD, серый), трансмембранные домены (TM, желтый), выделяющие TM2, который является частью поры канала (пурпурный ), внутриклеточный петлевой домен (IL, голубой) и C-концевой участок (голубой).(B) Пентамерное расположение субъединиц для образования функционального GlyR (C) Представление димера α 1– α 1 GlyR, где расположен сайт связывания глицина (GBS). Петли (A – C) и β -нитей (D – F), которые составляют GBS, также помечены. Аминокислоты из основной (F44, F63, R65, L117, L127, S129) и комплементарной субъединицы (F158, Y202, T204, F207) окрашены в красный и оранжевый цвет соответственно. IL основан на полной модели α 1 GlyR, описанной ранее Burgos et al.(2015a). Все изображения были созданы с использованием PyMOL.

Кроме того, некоторые элементы вторичной структуры и большинство остатков, взаимодействующих с внеклеточными лигандами, были идентифицированы посредством анализа этих структур. ECD, например, показал классическую бочкообразную структуру, образованную 10 β -нитями ( β 1– β 10), сопровождаемыми двумя α -спиралями на N-конце между β — пряди 3 и 4 (рис. 1А). Сайт связывания нейротрансмиттера расположен между двумя соседними субъединицами и образован тремя петлями (A, B, C) основной субъединицы (+) вместе с тремя β -нитями (D, E, F) комплементарной субъединицы ( -) (Анвин, 2005; Du et al., 2015; Хуанг и др., 2015). Более подробный анализ показал, что аминокислоты R65, T204, Y202, S129, F159 и P207 взаимодействуют с глицином в сайте связывания агониста (числа относятся к зрелой последовательности человеческого α 1 GlyR) (Du et al. , 2015; Huang et al., 2015) (рис. 1С). Эти остатки согласуются с данными, полученными в результате функциональных и мутагенезных исследований связывания агонистов (Rajendra et al., 1995; Laube et al., 2002; Pless et al., 2011; Yu et al., 2014).

На гомопентамерном α 1 GlyR имеется пять идентичных сайтов связывания агонистов.В гетеропентамерном GlyR наличие α / β и β / β интерфейсов связывания играет роль в изменении агонистического сродства и фармакологических свойств (Dutertre et al., 2012; Shan et al., 2012) . TM, с другой стороны, состоит из четырех амфипатических α -спиралей (TM1-4), где спирали TM2 образуют поры канала, а TM4 расположены на внешней поверхности, соответствующей области, которая взаимодействует с липидными компонентами нейрональной мембрана (Ma et al., 2005; Mowrey et al., 2013a) (рис.1, A и B). К сожалению, для облегчения кристаллизации этих белков большой внутриклеточный домен, который соединяет TM3 и TM4, был усечен или заменен короткими пептидными линкерами, поэтому в настоящее время экспериментально не разрешен (Thompson et al., 2010; Langlhofer et al., 2015).

Несмотря на отсутствие подробной структурной информации, данные по рецепторам 5-HT3 и nAChR убедительно свидетельствуют о наличии α спиралей во внутриклеточных областях (Unwin and Fujiyoshi, 2012; Hassaine et al., 2014). Кроме того, недавнее исследование с использованием методологий in silico и кругового дихроизма предположило существование спиральной конформации как в N-, так и в C-концевых областях IL в α 1 GlyR вблизи TM (Burgos et al., 2015a). ).

Переходы между открытым и закрытым состояниями

Доступные структуры эукариотических рецепторов Cys-петли в ожидаемых открытых / закрытых конформациях позволили изобразить некоторые события, которые могут хорошо представлять ключевые шаги, ведущие к открытию ионного канала.Например, в агонисте описаны структуры для nAChR (Unwin and Fujiyoshi, 2012), GluCl (Hibbs, Gouaux, 2011; Althoff et al., 2014) и α 1 GlyR (Du et al., 2015). связанное открытое состояние и связанное с антагонистом закрытое состояние. Структурное выравнивание каждого рецептора между его открытой и закрытой конформациями показало, что основные конформационные изменения в рецепторах Cys-петли хорошо сохраняются.

Вкратце, при активации связыванием агониста с ECD верхняя часть ECD поворачивается вокруг оси поры, в то время как нижняя часть ECD наклоняется к центру поры, что сопровождается значительным смещением петли C (Althoff et al., 2014; Du et al., 2015). Чтобы передать конформационные изменения в ECD доменам TM и открыть ионный канал, верхняя часть TM2, кажется, поворачивается наружу из-за смещения Cys-петли через β 10, создавая соединение TM2-TM3 внеклеточная петля к петле β 1– β 2.

Также было показано, что нижний участок TM2, соединенный с TM1 и связанный с петлей β 8– β 9, перемещается к оси поры вследствие смещения β 8– β 9 петель и последующее вращение TM1 (Du et al., 2015). Кроме того, TM3 и TM4 вращаются по часовой стрелке вокруг центра пучка спиралей, производя кажущееся полное вращение TM доменов (Althoff et al., 2014).

В настоящее время предполагается, что все эти конформационные изменения, вызванные связыванием агониста с ECD, на самом деле могут приводить к открытию ионного канала. Тем не менее, более тонкая картина, в которой также присутствуют промежуточные и десенсибилизированные состояния рецептора, ожидает дальнейших исследований.

Молекулярные сайты для функциональной регуляции GlyR

Доступность рецепторных структур семейства Cys-петель предоставляет информацию о локализации и возможных механизмах действия нескольких физиологически и других клинически значимых модуляторов (см. Таблицу 2).Например, эти исследования предоставили структурную информацию для GLIC и ELIC, связанных с ключевыми фармакологическими модуляторами, такими как общие анестетики (десфлуран, изофлуран, пропофол, кетамин) (Nury et al., 2011; Pan et al., 2012a; Kinde et al. , 2015), бензодиазепины (Spurny et al., 2012), ионы (Hilf et al., 2010; Hibbs, Gouaux, 2011; Zimmermann, Dutzler, 2011) и этанол (Sauguet et al., 2013a). Интересно, что некоторые из этих модуляторов обладают фармакологическими эффектами, противоположными тем, о которых сообщается в GlyR (таблица 2).К сожалению, только одно исследование предоставило структуру GlyR, связанного с одним модулятором, ивермектином, показав молекулярные взаимодействия этого противопаразитарного препарата с TM доменами субъединиц GlyR α 1 (Du et al., 2015). Несмотря на эти ограничения, имеющиеся данные позволяют описать молекулярные сайты для регуляции GlyR с помощью важных модуляторов.

ТАБЛИЦА 2

Экспериментально полученные структуры прокариотических LGIC с фармакологическими и физиологически релевантными соединениями

Все описанные здесь модуляторы были совместно кристаллизованы с их соответствующими рецепторами, что позволило провести анализ и описание каждого сайта связывания.

Одним химически простым лигандом, способным модулировать активность GlyR, является Zn 2+ , который хранится в синаптических пузырьках в глицинергических, ГАМКергических и глутаматергических нейронах. Когда этот ион высвобождается во время нейротрансмиссии, он может достигать концентраций более 100 мкМ М, что позволяет модулировать различные рецепторы, включая GlyR (Birinyi et al., 2001; Frederickson and Bush, 2001; Trombley et al., 2011). Zn 2+ модулирует α 1 GlyR двухфазным образом в зависимости от концентрации.Усиление вызванных глицином токов происходит при низких концентрациях (<10 μ M), тогда как более высокие концентрации (> 10 μ M) вызывают ингибирование (Bloomenthal et al., 1994; Laube et al., 1995).

Эта двухфазная модуляция, по-видимому, связана с разными сайтами связывания в структуре GlyR. Сайты связывания для Zn 2+ , связанные с потенцированием глицинергических токов, расположены на внешней стороне N-концевого домена α 1 субъединиц GlyR и состоят из аминокислот, образующих β -цепей в ECD ( Инжир.2, А и Б). К ним относятся аминокислоты D80, E192 и D194, дополненные h315 и T151 (Laube et al., 1995; Laube et al., 2000; McCracken et al., 2013).

Рис. 2.

Предполагаемые сайты связывания для выбранных важных модуляторов в структуре α 1 GlyR. (A) Изображение гомопентамерного α 1 GlyR (PDB: 3JAE), где показаны сайты связывания для низких (пурпурный) и высоких (синий) концентраций Zn 2+ . Также показаны аминокислоты, образующие общую полость для этанола (красный) и общих анестетиков (оранжевый).(B) Подробный вид аминокислот, участвующих в потенцировании Zn 2+ низкими концентрациями (<10 мк M), и (C) вид внутренних пор, который показывает аминокислоты, связанные с ингибирующими эффектами Zn 2+. . (D) сайт связывания этанола и общих анестетиков; основные аминокислоты окрашены в красный цвет, а остатки, дополняющие полость, окрашены в оранжевый цвет. Все изображения были созданы с использованием PyMOL.

Связывание Zn 2+ с GlyR приводит к увеличению вероятности открытия канала и продолжительности всплеска, что указывает на стабилизацию открытого состояния после связывания агониста, даже превращая таурин, частичный агонист GlyR, в полный агонист (Laube et al. ., 2000; Миллер и др., 2008; Тромбли и др., 2011; Фарли и Михич, 2015). С другой стороны, аминокислоты, связанные с ингибирующим действием Zn 2+ в α 1 GlyR, расположены на внутренней стороне ECD, ориентированной в сторону преддверия, и включают остатки h207, h209, T112 и T133 (рис. 2, A и C) (Miller et al., 2005b).

Ингибирование тока, вызванного глицином, связано с уменьшением открытия канала (закрытием) и снижением эффективности агонистов (Miller et al., 2005a; Это и др., 2007). Интересно, что в последние годы было показано, что модуляция Zn 2+ связана с эффектами этанола на GlyR, где Zn 2+ увеличивает усиление глицинергических токов в присутствии этанола, которое происходит в связанных областях мозга. с развитием алкогольной зависимости (McCracken et al., 2010b, 2013; Morud et al., 2015).

Другой важной группой модуляторов являются общие анестетики, которые вызывают заметное угнетение некоторых функций ЦНС, что приводит к расслаблению мышц, амнезии и потере сознания (Rudolph and Antkowiak, 2004).Летучие анестетики, такие как изофлуран, галотан и энфлуран, усиливают вызванные глицином токи в α 1 GlyR (Harrison et al., 1993; Downie et al., 1996; Mascia et al., 1996). Усиление, вызываемое этой группой фармакологических агентов, связано с положительной модуляцией глицинергических синапсов, которые демонстрируют увеличенную кинетику постоянной времени затухания и частоту глицинергических ингибирующих постсинаптических потенциалов (Yamashita et al., 2001; Cheng and Kendig, 2002).

На основании мутагенеза и физиологических исследований предполагается, что сайт связывания летучих анестетиков на GlyR состоит из аминокислот, расположенных в TM2 и TM3, которые образуют внутрисубъединичную полость (Mihic et al., 1997; Робертс и др., 2006; Duret et al., 2011) и включают остатки S267 (TM2) и A288 (TM3) (Horani et al., 2015) (рис. 2A, D). Аналогичная полость описана в GABA A R, где аминокислоты S270 (TM2) и A291 (TM3) в субъединице α 1 оказались важными для потенцирования (Mascia et al., 2000; Jung et al., 2005; Юнг и Харрис, 2006). Этот сайт связывания используется совместно с общими анестетиками и алкоголем и обсуждался ранее в другом месте (Lobo and Harris, 2005; Howard et al., 2014; Olsen et al., 2014; Trudell et al., 2014).

Кроме того, недавние исследования показали, что эндовенозный анестетик пропофол связывается с этой полостью в более поверхностном положении по сравнению с десфлураном. Однако этот участок не единственный, который важен для общей анестезии. Например, в другом исследовании сообщалось о наличии по крайней мере одного остатка (F380) вне этой полости, расположенного в МА-участке IL, который необходим для действия пропофола на α 1 GlyR (Moraga-Cid et al., 2011). Однако сообщалось, что этот предполагаемый сайт связывания является эксклюзивным для пропофола, поскольку замена остатка F380 на аланин ослабляет усиление глицинергических токов на пропофол без изменения базальной активности рецептора или модуляции другими анестетиками, такими как изофлуран или этамидат ( Moraga-Cid et al., 2011). Что еще более интересно, эта мутация не влияет на действие этанола на GlyR, подтверждая мнение о том, что фармакологические действия пропофола и этанола, возможно, опосредуются разными участками белка.

Другим фармакологическим соединением, влияющим на регуляцию GlyR, является этанол, один из самых популярных наркотиков во всем мире. Острые эффекты алкоголя в ЦНС могут варьироваться от снижения сенсорных рефлексов, растормаживания социального поведения и эйфории до депрессии, умственной бессвязности, комы и смерти (Spanagel, 2009; Perkins et al., 2010). Несмотря на значительное влияние этанола на здоровье и общество, его механизм действия трудно объяснить, и было предложено несколько теорий.

Одной из наиболее распространенных молекулярных мишеней для объяснения сложных эффектов этанола у млекопитающих является LGIC (Harris et al., 2008; Howard et al., 2014). Исследования культивируемых нейронов млекопитающих и рекомбинантных рецепторов определили, что некоторые LGIC модулируются клинически значимыми концентрациями этанола (Lovinger et al., 1989; Aguayo, 1990; Lovinger, 1991; Aguayo and Pancetti, 1994; Cardoso et al., 1999; Moykkynen) и др., 2003). Дополнительный анализ показал, что низкие концентрации этанола (≤50 мМ) усиливают глицинергические токи за счет увеличения кажущегося сродства GlyR без изменения эффективности (Aguayo et al., 1996; Кроуфорд и др., 2007; Perkins et al., 2008) и показали, что влияние алкоголя на глицинергические токи регулируется в ходе развития культивируемых спинномозговых нейронов (Tapia et al., 1997; Tapia and Aguayo, 1998). Другие исследования показали, что этанол влияет на GlyR, экспрессируемый в подъязычных мотонейронах (Eggers, Berger, 2004; Aguayo et al., 2014), спинном мозге (Celentano et al., 1988; Mariqueo et al., 2014) и вентральной области покрышки. нейроны (Ye et al., 2001).

Были предложены две основные гипотезы для объяснения действия этанола на GlyR.Первый и наиболее изученный и признанный механизм предполагает, что функциональная модуляция токов, активируемых глицином, происходит за счет прямого взаимодействия спирта с группой аминокислот, которые образуют связывающий карман, который является общим с другими длинноцепочечными спиртами и общими анестетиками ( Лобо и Харрис, 2005; Харрис и др., 2008). Этот сайт связывания этанола (фиг. 2D) включает остатки S267 (TM2) и A288 (TM3), дополненные Q266 и M287. Помимо этого сайта, были предложены дополнительные карманы связывания для этанола в домене TM4 (т.е.е., I409, Y410 и K411) (Lobo et al., 2006; McCracken et al., 2010a) и в ECD (т.е. A52) (Crawford et al., 2007; Perkins et al., 2008). Таким образом, вероятно, что на GlyR существует несколько связывающих карманов для этанола, и они должны заполняться по мере увеличения концентрации лиганда.

Другая гипотеза была предложена для объяснения эффектов этанола при фармакологических концентрациях (≤100 мМ), включая внутриклеточный механизм и модуляцию G-белка. Эти исследования рекомбинантного и нативного GlyR определили, что усиление рецептора этанолом связано с внутриклеточной модуляцией G βγ (Yevenes et al., 2008, 2010). Связывание G βγ с IL α 1 субъединиц способствует открытию канала GlyR, показывая увеличение амплитуды вызванной глицином и вероятности открытия GlyR (nPo) ​​(Yevenes et al., 2003). Более подробный анализ показал, что физические контакты между двумя группами основных аминокислот в IL α 1 субъединицы ( 316 RFRRK 320 и 385 KK 386 ) имеют решающее значение для взаимодействия между GlyR и G βγ (Yevenes et al., 2006, 2008). Замены этих основных остатков аланинами генерировали GlyR с низкой чувствительностью к этанолу в фармакологическом диапазоне (≤100 мМ) и не отображали изменений функции ионных каналов или чувствительности к другим агентам, таким как изофлуран, пропофол, цинк, альфаксолон или более длительное время. -спирты, что указывает на высокую степень селективности (Yevenes et al., 2008; Yevenes and Zeilhofer, 2011).

Будущие направления изучения регуляторных механизмов GlyR

Несмотря на то, что в последние годы в области GlyR был получен значительный объем информации, есть важные вопросы, которые необходимо решить: 1) состав GlyR должен быть картируется по всей ЦНС с точки зрения субъединичного состава и локализации нейронов.2) Селективные агонисты, антагонисты и модуляторы должны быть разработаны для конкретных субъединиц GlyR. Такие соединения прольют свет на физиологическую и патологическую роль различных подтипов GlyR у животных и людей. 3) Структурные исследования должны проводиться с фармакологическими концентрациями лигандов. Вероятно, что будущие усовершенствования техники покажут существование нескольких сайтов связывания для большинства модуляторов в GlyR.

Заключение

Таким образом, GlyR предлагает в значительной степени неизведанное новое измерение для понимания того, как тормозные рецепторы играют разные роли в ЦНС от спинного мозга до коры.Дополнительные структурные и функциональные данные о различных подтипах GlyR и ключевых вспомогательных белках, вместе с разработкой субъединичных селективных лигандов, действующих на синаптические и несинаптические рецепторы и генетически модифицированных животных, должны расширить наши знания об этих измерениях. Можно ожидать, что фармакотерапия на основе глицинергических средств будет разработана для мышечного тонуса, контроля моторики, передачи боли, седативного эффекта, познания и вознаграждения.

Благодарности

Авторы благодарят Лорен Агуайо за редактирование рукописи и за экспертную техническую помощь в течение многих лет.ASPET благодарит доктора Кэти Стронг за редактирование этой статьи.

Авторские взносы

Участвовал в написании рукописи: Бургос, Йевенес, Агуайо.

Сноски

    • Получено 21 июня 2016 г.
    • Принято 8 июля 2016 г.
  • Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения Национального института злоупотребления алкоголем и алкоголизмом [Grant RO1 AA15150], Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico [Grant 1140515] и Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica [Grant DPI 20140008].

  • dx.doi.org/10.1124/mol.116.105726.

Аббревиатуры

AChBP
ацетилхолинсвязывающий белок
CNS
центральная нервная система
ECD
внеклеточный домен
ELIC
ионный канал lht
рецепторы серотонина типа 3
GABA A R
GABA A рецептор (ы)
G βγ
G-белок βγ субъединицы
GLIC4 9883 нарушенный ионный канал
GluCl
хлоридный канал, управляемый глутаматом
GlyR
рецептор (ы) глицина
IL
домен внутриклеточной петли
LGIC
лиганд-управляемый ионный канал
sacholine
TM
трансмембранный домен
  • Copyright © 2 016 Американского общества фармакологии и экспериментальной терапии

Федеральный регистр :: Glycine max

Начать преамбулу

Агентство по охране окружающей среды (EPA).

Окончательное правило.

Этот регламент устанавливает исключение из требования толерантности к остаткам фермента Glycine max , устойчивого к гербицидам ацетолактатсинтазы (GM-HRA), когда он используется в качестве инертного защитного ингредиента, содержащегося в растениях, в пищевых продуктах и ​​кормах или на них. соя. Pioneer Hi-Bred International, Inc. (DuPont Pioneer) подала петицию в EPA в соответствии с Федеральным законом о пищевых продуктах, лекарствах и косметических средствах (FFDCA) с просьбой об освобождении от требований толерантности.Этот регламент устраняет необходимость устанавливать максимально допустимый уровень для остатков Glycine max гербицидно-устойчивого ацетолактатсинтазного фермента в пищевых продуктах и ​​кормах сои или на них.

Это постановление вступает в силу 8 февраля 2013 г. Возражения и запросы о слушании должны быть получены не позднее 9 апреля 2013 г. и должны быть поданы в соответствии с инструкциями, содержащимися в 40 CFR часть 178 (см. Также Раздел I.C. ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ ).

Документ об этом действии, обозначенный идентификационным номером (ID) EPA-HQ-OPP-2012-0795, доступен по адресу http://www.regulations.gov или в Общественном журнале нормативных документов Управления программ по пестицидам ( OPP Docket) в Справочном центре Агентства по охране окружающей среды (EPA / DC), EPA West Bldg., Rm. 3334, 1301 Проспект Конституции, Северо-Запад, Вашингтон, округ Колумбия, 20460-0001. Общественный читальный зал открыт с 8:30.м. до 16:30 с понедельника по пятницу, кроме официальных праздников. Номер телефона Общественного читального зала: (202) 566-1744, а номер телефона для служебной записки: (703) 305-5805. Ознакомьтесь с инструкциями для посетителей и дополнительной информацией о досье на странице http://www.epa.gov/ dockets.

Начать дополнительную информацию

Susanne Cerrelli, Отдел биопестицидов и предотвращения загрязнения (7511P), Управление программ по пестицидам, Агентство по охране окружающей среды, 1200 Pennsylvania Ave.NW., Вашингтон, округ Колумбия, 20460-0001; телефон: (703) 308-8077; адрес электронной почты: [email protected]

Конец Дополнительная информация Конец преамбулы Начать дополнительную информацию

I. Общая информация

A. Подходит ли мне это действие?

Это действие может потенциально повлиять на вас, если вы производитель сельскохозяйственной продукции, производитель пищевых продуктов или пестицидов. Следующий список кодов Североамериканской системы промышленной классификации (NAICS) не является исчерпывающим, а скорее представляет собой руководство, которое поможет читателям определить, применим ли к ним этот документ.Потенциально затронутые организации могут включать:

  • Растениеводство (код НАИКС 111).
  • Животноводство (код НАИКС 112).
  • Пищевая промышленность (код НАИКС 311).
  • Производство пестицидов (код НАИКС 32532).

B. Как я могу получить электронный доступ к другой связанной информации?

Вы можете получить доступ к часто обновляемой электронной версии 40 CFR часть 174 через сайт e-CFR государственной типографии по адресу http: // www.ecfr.gov/ cgi-bin / text-idx? & c = ecfr & tpl = / ecfrbrowse / Title40 / 40tab_ 02.tpl.

C. Как я могу подать возражение или запрос о слушании?

Согласно разделу 408 (g) FFDCA, 21 U.S.C. 346a, любое лицо может подать возражение против любого аспекта этого правила, а также может потребовать слушания по этим возражениям. Вы должны подать возражение или запросить слушание по этому правилу в соответствии с инструкциями, приведенными в 40 CFR, часть 178. Чтобы обеспечить надлежащее получение EPA, вы должны указать идентификационный номер документа EPA-HQ-OPP-2012-0795 в строке темы на первой странице вашего сообщения.Все возражения и запросы о слушании должны быть в письменной форме и должны быть получены клерком, ведущим слушание, не позднее 9 апреля 2013 г. Адреса для почтовой и ручной доставки возражений и запросов о слушании указаны в 40 CFR 178.25 (b).

В дополнение к подаче возражения или запроса о слушании к клерку, проводящему слушания, как описано в 40 CFR часть 178, пожалуйста, отправьте копию заявки (за исключением любой конфиденциальной деловой информации (CBI)) для включения в публичный реестр. Информация, не помеченная как конфиденциальная в соответствии с 40 CFR, часть 2, может быть раскрыта EPA публично без предварительного уведомления.Отправьте копию вашего возражения или запроса о слушании, не принадлежащую CBI, с идентификационным номером в реестре EPA-HQ-OPP-2012-0795 одним из следующих способов:

  • Федеральный портал электронного регулирования: http://www.regulations.gov. Следуйте интерактивным инструкциям по отправке комментариев. Не отправляйте в электронном виде информацию, которую вы считаете CBI, или другую информацию, раскрытие которой ограничено законом.
  • Mail: Документ OPP, Справочный центр Агентства по охране окружающей среды (EPA / DC), (28221T), 1200 Pennsylvania Ave.NW., Вашингтон, округ Колумбия 20460-0001.
  • Ручная доставка: Чтобы принять особые меры для ручной доставки или доставки информации в коробках, следуйте инструкциям на сайте http://www.epa.gov/ dockets / contacts.htm.

Дополнительные инструкции по комментированию или посещению досье, а также более подробная информация о досье в целом доступны по адресу http://www.epa.gov/ dockets.

II.Справочная информация и установленные законом выводы

В Федеральном реестре от 7 ноября 2012 г. (77 FR 66781) (FRL-9367-5) EPA выпустило документ в соответствии с разделом 408 (d) (3) FFDCA, 21 U.S.C. 346a (d) (3), объявляя о подаче петиции о толерантности к пестицидам (PP 2E8059) компанией Pioneer Hi-Bred International, Inc. (DuPont Pioneer), 7100 NW., 62nd Avenue, P.O. Box 1000, Johnston, Iowa, 50131. В петиции просили внести поправки в 40 CFR, часть 174, установив исключение из требования о допуске остатков Glycine max устойчивой к гербицидам ацетолактатсинтазы (GM-HRA) при использовании в качестве Инертный ингредиент защитного вещества, содержащегося в растениях (PIP), в продуктах питания и кормах из сои или на них.В этом документе содержится ссылка на резюме петиции, подготовленное петиционером, Pioneer Hi-Bred International, Inc. (DuPont Pioneer), которое доступно в досье http://www.regulations.gov. В ответ на уведомление о подаче комментариев не поступало.

Раздел 408 (c) (2) (A) (i) FFDCA позволяет EPA устанавливать освобождение от требования о допуске (законный предел для остатков пестицидных химических веществ в продуктах питания или на них) только в том случае, если EPA определяет, что освобождение «безопасно.Раздел 408 (c) (2) (A) (ii) FFDCA определяет «безопасный» как означающий, что «существует разумная уверенность в том, что совокупное воздействие остатков пестицидного химического вещества не приведет к ущербу, включая все ожидаемые воздействия с пищей и все другие воздействия, о которых имеется достоверная информация ». Это включает воздействие через питьевую воду и в жилых помещениях, но не включает воздействие на рабочем месте. В соответствии с разделом 408 (c) (2) (B) FFDCA, при установлении или сохранении в силе освобождения от требования допуска EPA должно учитывать факторы, изложенные в разделе 408 (b) (2) FFDCA ( C), которые требуют от Агентства по охране окружающей среды уделять особое внимание воздействию остатков пестицидного химического вещества на младенцев и детей при установлении толерантности и «обеспечивать разумную уверенность в том, что младенцам и детям не будет причинен вред в результате совокупного воздействия пестицида. химический остаток * * *.Кроме того, раздел 408 (b) (2) (D) FFDCA требует, чтобы Агентство рассматривало «имеющуюся информацию, касающуюся кумулятивного воздействия остатков конкретного пестицида» и «других веществ, имеющих общий механизм токсичности».

EPA выполняет ряд анализов для определения рисков совокупного воздействия остатков пестицидов. Во-первых, EPA определяет токсичность пестицидов. Во-вторых, EPA изучает воздействие пестицидов через пищу, питьевую воду и другие воздействия, возникающие в результате использования пестицидов в жилых помещениях.

III. Токсикологический профиль

В соответствии с разделом 408 (b) (2) (D) FFDCA, EPA проанализировало имеющиеся научные данные и другую соответствующую информацию в поддержку этого действия и рассмотрело его достоверность, полноту и надежность, а также связь этой информации с риском для человека. . EPA также рассмотрело имеющуюся информацию о вариабельности чувствительности основных идентифицируемых подгрупп потребителей, включая младенцев и детей.

A. Обзор характеристик продукта

Белок ацетолактатсинтазы (ALS), также известный как синтаза ацетогидроксикислот (AHAS), является ключевым ферментом, который катализирует первый общий этап биосинтеза незаменимых аминокислот с разветвленной цепью и является обязательным для развития растений. Ген, кодирующий белок GM-HRA, gm-hra, , происходит от гена gm-als I , природного гена сои, который кодирует белок ацетолактатсинтазы I (GM-ALS I).Были внесены изменения в последовательность гена ДНК для gm-als I для получения gm-hra. Затем модифицированный ген был введен в геном растения посредством бомбардировки частицами (фрагментом PHP30987A). Белок GM-HRA Start Printed Page 9319 имеет длину 604 аминокислоты с прогнозируемой молекулярной массой 65 килодальтон (кДа) и на> 99% гомологичен нативному белку GM-ALS I, продуцируемому в соевых бобах. Эта незначительная модификация эндогенного белка GM-ALS I в белок GM-HRA дает фермент, устойчивый к гербицидам, ингибирующим ALS.Таким образом, белок GM-HRA будет полезен в качестве селектируемого маркера при трансформации сои. Как часть генетической конструкции, введенной в геном растения, GM-HRA сама по себе не обладает инсектицидной активностью и, следовательно, функционально инертна как часть PIP. Потенциально GM-HRA также может служить признаком толерантности к гербицидам соевых бобов, использование которых регулируется отдельной юрисдикцией Министерства сельского хозяйства США (USDA).

B. Оценка токсичности для млекопитающих

DuPont Pioneer представил данные об острой пероральной токсичности, демонстрирующие отсутствие токсичности для млекопитающих при относительно высоких уровнях воздействия чистого белка GM-HRA.Эти данные демонстрируют безопасность продукта на уровне, значительно превышающем максимально возможные уровни воздействия, которые обоснованно ожидаются для сельскохозяйственных культур (ссылка 1).

Исследование острой пероральной токсичности на мышах показало, что GM-HRA нетоксичен (ссылка 2). Двум группам из пяти самцов и пяти самок мышей перорально (через желудочный зонд) вводили 2000 миллиграммов / килограммов массы тела (мг / кг массы тела) тестируемого вещества, биохимически и функционально эквивалентного белка GM-HRA, продуцируемого микробами. При вскрытии трупа у подопытных животных не было выявлено неблагоприятных клинических признаков или результатов.

Когда белки токсичны, они, как известно, действуют через острых механизмов и при очень низких уровнях доз (ссылка 3). Поскольку GM-HRA не вызывает острых пероральных эффектов даже при относительно высоких дозах (до 2000 мг / кг массы тела), белок GM-HRA не считается токсичным. В поддержку этого вывода сравнения аминокислотных последовательностей между белком GM-HRA и известными токсичными белками в белковых базах данных не обнаружили сходства, которое противоречило бы результатам острого перорального исследования.

C. Оценка аллергенности

Поскольку GM-HRA представляет собой белок, учитывалась аллергическая чувствительность. В настоящее время не существует окончательных тестов для определения аллергенного потенциала новых белков. Современные научные знания показывают, что обычные пищевые аллергены имеют тенденцию быть устойчивыми к разложению кислотой и протеазами; они также могут быть гликозилированы и присутствуют в пище в высоких концентрациях. Используя подход «совокупности доказательств», EPA рассмотрело источник признака, сходство аминокислотной последовательности с известными аллергенами, его распространенность в пище и биохимические свойства белка, включая in vitro усвояемость в моделированной желудочной жидкости ( SGF) и гликозилирование (см.4). Результаты анализа EPA следующие:

1. Источник признака. Организм-донор — Glycine max (соя), который имеет эндогенный ген ( gm-als I ), кодирующий белок ацетолактатсинтазы I (GM-ALS I). Хотя соя является одним из основных пищевых аллергенов, ни один из известных соевых аллергенов не является членом семейства белков ALS, включая белок ALS. Ферменты БАС широко распространены в природе, и генов, а также генов были выделены из бактерий, грибов, водорослей и растений (см.5, 6, 7 и 8). Аминокислотное секвенирование (анализ BLASTP) дало 12 451 структурно или функционально родственный образец белка (ссылка 9). Ген gm-hra , кодирующий предлагаемый белок GM-HRA, инертный ингредиент PIP, был получен путем трансформации встречающегося в природе гербицида. -чувствительная генетическая последовательность gm-als I . Новый ген был введен в растение, и полученный в результате устойчивый к гербицидам белок GM-HRA отличается от белка ALS I всего на две аминокислоты. Обе из двух аминокислотных замен в GM-HRA уже присутствуют в коммерчески доступных сортах сельскохозяйственных культур (соя, подсолнечник, кукуруза и канола (см.10, 11, 12 и 13)), которые обладают естественной толерантностью к гербицидам, ингибирующим БАС.

2. Аминокислотная последовательность. Сравнение аминокислотной последовательности GM-HRA с известными аллергенами не обнаружило существенного общего сходства или идентичности последовательностей на уровне восьми смежных аминокислотных остатков, уровень чувствительности, необходимый для обнаружения потенциальных аллергенов.

3. Распространенность в пище. Ферменты ALS были частью рациона человека благодаря их присутствию в соевых бобах и других товарных пищевых культурах (соя, кукуруза, пшеница, рис и канола).Некоторые из этих ферментов содержат естественные мутации, которые включают те же две аминокислотные замены, что и белок GM-HRA, которые делают их толерантными к гербицидам, ингибирующим БАС (ссылка 12), и о пищевых аллергиях, связанных с БАС, не сообщалось.

4. Усвояемость. Белок GM-HRA был быстро переварен (менее чем за 30 секунд) в искусственной желудочной жидкости млекопитающих (которая имеет очень кислый pH 1,2 и включает фермент переваривания белка, пепсин, обнаруженный в желудочной жидкости) после инкубации при 37 ° C. .

5. Гликозилирование. Белок GM-HRA, экспрессируемый в сое, не гликозилирован. Учитывая всю доступную информацию, EPA пришло к выводу, что вероятность того, что GM-HRA может быть пищевым аллергеном, минимальна.

IV. Совокупные воздействия

При изучении совокупного воздействия раздел 408 FFDCA предписывает EPA учитывать имеющуюся информацию, касающуюся воздействия остатков пестицидов в продуктах питания и всех других непрофессиональных воздействий, включая питьевую воду из грунтовых или поверхностных вод и воздействие пестицидов в садах, лужайках, или здания (жилые и другие внутренние помещения).

Агентство рассмотрело имеющуюся информацию об общих уровнях воздействия на потребителей и основных идентифицируемых подгрупп потребителей, включая младенцев и детей, предлагаемого инертного остатка пестицида PIP, белка GM-HRA и других родственных веществ. Этот белок представляет собой фермент, продуцируемый в сое геном, который был генетически получен из природного гена сои, который кодирует чувствительный к гербицидам фермент ALS. Измененный ген повторно вводится в соевые бобы, и полученный белок GM-HRA имеет более 99% сходства с природным чувствительным к гербицидам белковым ферментом, отличаясь только двумя аминокислотами (см.13). Эти незначительные изменения придают устойчивость фермента к гербицидным пестицидам, которые ингибируют ферменты ALS, что позволяет использовать белок GM-HRA в качестве селектируемого маркера устойчивости к гербицидам при трансформации сои. Две аминокислотные замены, обнаруженные в сконструированном белке GM-HRA, также встречаются в виде естественных мутаций в других коммерчески доступных, не генетически модифицированных сортах сельскохозяйственных культур, которые толерантны к гербицидам, ингибирующим БАС, и, таким образом, к воздействию на человека природного белка, кроме того. к предлагаемому PIP инертному, ожидается.Однако единственный вероятный путь воздействия на человека — это его питание, поскольку предлагаемый инертный ингредиент PIP (и связанные с ним природные ферменты ALS) содержится в клетках растений, что снижает потенциальное воздействие на человека другими путями до незначительного. Воздействие при использовании в жилых помещениях или на лужайках не ожидается, поскольку все участки предполагаемого использования являются сельскохозяйственными. Хотя маловероятно, что если остатки GM-HRA появятся в питьевой воде в результате его использования в качестве инертного ингредиента для PIP в сое, риск для людей будет очень маловероятным, учитывая отсутствие у этого белка токсичности для млекопитающих, продемонстрированное при острой пероральной терапии. исследование токсичности и отсутствие сходства аминокислот с известными белковыми токсинами и аллергенами (см. Блок III).

V. Кумулятивные эффекты веществ с общим механизмом токсичности

Раздел 408 (b) (2) (D) (v) FFDCA требует, чтобы при рассмотрении вопроса об установлении, изменении или отмене допуска Агентство рассматривало «имеющуюся информацию», касающуюся кумулятивного воздействия остатков конкретного пестицида и «Другие вещества, имеющие общий механизм токсичности».

Основываясь на результатах испытаний на острую токсичность, EPA пришло к выводу, что предлагаемый инертный PIP, GM-HRA, не токсичен.EPA также пришло к выводу, что из-за активности этого катаболического фермента в сое или других съедобных культурах не образуются токсичные или аллергенные метаболиты. Кроме того, GM-HRA, кодируемый геном gm-hra , ранее оценивался на безопасность Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) в двух других случаях трансгенной сои. В одном случае ген был модифицирован для производства соевого масла с высоким содержанием олеина (OECD Unique ID No. DP-3Ø5423-1), а другой обеспечил устойчивость к глифосату и ингибирующим ALS гербицидам (OECD Unique ID No.DP-356Ø43-5) (ссылки 14 и 15). Основываясь на представленной информации, FDA пришло к выводу, что профили безопасности этих соевых бобов, белок GM-HRA существенно не отличались от профилей других продаваемых сортов сои, и никаких проблем с безопасностью этого белка выявлено не было (ссылки 16 и 17). .

Агентство

EPA заключает, что нет никаких кумулятивных эффектов, связанных с GM-HRA, ожидаемых от предлагаемого использования в качестве инертного ингредиента для PIP в сое. Информацию об усилиях EPA по определению того, какие химические вещества обладают общим механизмом токсичности, и по оценке совокупного воздействия таких химикатов, см. На веб-сайте EPA по адресу http: // www.epa.gov/pesticides / cumulative.

VI. Определение безопасности для населения США, младенцев и детей

Представленные и процитированные данные относительно потенциального воздействия на здоровье белка GM-HRA включают характеристику экспрессированного белка GM-HRA в сое, а также острую оральную токсичность, сравнение аминокислотных последовательностей и исследование усвояемости in vitro . Результаты этих исследований были использованы для оценки риска для человека, а также рассмотрены валидность, полнота и надежность имеющихся данных исследований.

Как обсуждалось в разделе III, представленные данные об острой пероральной токсичности подтверждают предположение, что белок GM-HRA не токсичен для человека. Более того, анализ аминокислотной последовательности показал, что GM-HRA не похож ни на один известный белковый токсин или аллерген. Другие данные, рассматриваемые как часть оценки аллергенности, включали: структурное и функциональное сходство белка GM-HRA с природными белками ALS из сои и других пищевых культур; белки БАС не связаны с пищевой аллергенностью; белок быстро разлагается в исследовании перевариваемости в сильнокислой среде; и белок GM-HRA не гликозилирован при экспрессии в растении.Следовательно, не ожидается, что белок GM-HRA является аллергеном человека.

Наконец, особенно в отношении младенцев и детей, раздел 408 (b) (2) (C) FFDCA предусматривает, что EPA должно оценивать имеющуюся информацию о моделях потребления среди младенцев и детей, особой восприимчивости младенцев и детей к остаткам пестицидных химических веществ. и кумулятивное воздействие на младенцев и детей остатков и других веществ с общим механизмом токсичности. Кроме того, раздел 408 (b) (2) (C) FFDCA предусматривает, что EPA применяет дополнительный десятикратный запас безопасности для младенцев и детей в случае пороговых эффектов для учета пренатальной и послеродовой токсичности и полноты базы данных. если только EPA не определит, что для младенцев и детей будет безопасен другой запас прочности.

Основываясь на своем обзоре и рассмотрении всей доступной информации, Агентство заключает, что существует разумная уверенность в том, что населению США, включая младенцев и детей, не будет причинен вред в результате совокупного воздействия остатков белка GM-HRA и генетический материал, необходимый для его производства, когда он используется в качестве инертного ингредиента для ГПГ в пищевых и кормовых товарах из сои или на них. Сюда входят все ожидаемые воздействия с пищей и все другие воздействия, по которым имеется надежная информация.Агентство также пришло к выводу, по причинам, более подробно обсужденным выше, что нет пороговых эффектов, вызывающих озабоченность, и, как результат, что дополнительный запас безопасности для младенцев и детей в данном случае не нужен.

VII. Другие соображения

A. Аналитическая методология правоприменения

Аналитический метод не требуется для правоприменительных целей, поскольку Агентство устанавливает освобождение от требования о допуске без каких-либо численных ограничений.

B. Международные пределы остатков

При принятии решений о допусках EPA стремится по возможности согласовать допуски США с международными стандартами в соответствии со стандартами безопасности пищевых продуктов и методами ведения сельского хозяйства США. EPA учитывает международные максимальные пределы остатков (MRLs), установленные Комиссией Codex Alimentarius (Codex), как того требует раздел 408 (b) (4) FFDCA. Кодекс Алиментариус — это совместная программа пищевых стандартов Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций / Всемирной организации здравоохранения, которая признана международной организацией, устанавливающей стандарты безопасности пищевых продуктов, в торговых соглашениях, участником которых являются Соединенные Штаты.EPA может установить допуск, отличный от MRL Кодекса; однако раздел 408 (b) (4) FFDCA требует, чтобы EPA объяснило причины отклонения от уровня Кодекса.

Кодекс не установил MRL для белка GM-HRA в сое.

VIII. Выводы

Таким образом, освобождение от требования толерантности установлено для остатков фермента Glycine max , устойчивого к гербицидам ацетолактатсинтазы (GM-HRA) в продуктах питания и кормах сои или на них, когда они используются в качестве инертных защитных средств растений. ингредиент.

IX. Список литературы

1. Агентство по охране окружающей среды США. 2012. Обзор характеристик продукта и данных о здоровье человека для белка Glycine max , толерантного к гербицидам ацетолактат-синтазы (GM-HRA), экспрессированного в сое Event 82117 (уникальный идентификатор OECD. DP-Ø82117-3) в поддержку освобождения от требований о толерантности (петиция № 2E8059) при использовании в качестве инертного ингредиента для защиты растений (PIP) в сое. Меморандум от A. Wagoner и J. Kough, Ph.D. С. Черрелли. (От 20 декабря 2012 г.).

2. Finlay, C. (2006) GM-HRA: Исследование острой пероральной токсичности на мышах. Отчет об исследовании № PHI-2006-008, неопубликованное исследование, подготовленное E.I. du Pont de Nemours and Company, 9 августа 2006 г. 41 стр. MRID № 48872004.

3. Sjoblad, R.D., J.T. Макклинток и Р. Энглер (1992) «Токсикологические аспекты белковых компонентов биологических пестицидных продуктов», Нормативная токсикология и фармакология 15: 3-9.

4. CAC (2003) Alinorm 03/34: Совместная программа ФАО / ВОЗ по стандартам на пищевые продукты. Комиссия Кодекса Алиментариус, Двадцать пятая сессия, 30 июля 2003 г. Рим, Италия. Приложение III: Руководство по проведению оценки безопасности пищевых продуктов, полученных из растений с рекомбинантной ДНК; Приложение IV: Приложение по оценке возможной аллергенности. CAC, 47-60.Начать печатную страницу 9321

5. Фриден, П., Донеган, Дж., Маллен, Дж., Цуй, П., Фрейндлих, М., Эоян, Л., Вебер Р., Сильверман П. (1985) Локус ilvB из Escherichia coli K-12 представляет собой оперон, кодирующий обе субъединицы синтазы ацетогидроксикислот I. Nucleic Acids Research 13: 3979-3993.

6. Falco, S.C., Dumas, K.D., и Livak, K.J. (1985) Нуклеотидная последовательность гена дрожжевого ILV2, кодирующего ацетолактатсинтазу. Исследование нуклеиновых кислот 13: 4011-4027.

7. Reith, M. и Munholland, J. (1995) Полная нуклеотидная последовательность генома хлоропласта Porphyra purpurea . Репортер по молекулярной биологии растений 7: 333-335.

8. Mazur, B., Chiu, C.F., and Smith, J.E. (1987) Выделение и характеристика генов растений, кодирующих ацетолактатсинтазу, фермент-мишень для двух классов гербицидов. Физиология растений 85: 1110-1117.

9. Krauss, A. (2012) Оценка сходства аминокислотной последовательности белка GM-HRA с наборами данных последовательностей белка NCBI. Отчет об исследовании № PHI-2006-071 / 070. Неопубликованное исследование, подготовленное Pioneer Hi-Bred International, Inc., 23 января 2012 г. 8251 стр. MRID № 48872006.

10. Себастьян, С.А., Фейдер, Г.М., Ульрих, Дж.Ф., Форни, Д.Р., Чалефф, Р.С. (1989) Полудоминантная мутация сои для устойчивости к гербицидам сульфонилмочевины. Crop Science 29: 1403-1408.

11. Lee, KY, Townsend, J., Tepperman, J., Black, M., Chiu, CF, Mazur, B., Dunsmuir, P., and Bedbrook, J. (1988) Молекулярная основа гербицида сульфонилмочевины устойчивость табака. Журнал EMBO 7 (5): 1241-1248.

12. Тан С., Эванс Р. и Сингх Б. (2006) Гербицидные ингибиторы биосинтеза аминокислот и устойчивые к гербицидам культуры. Аминокислоты 30: 195-204.

13. Локк, М., Крессман, Б., Лу, А., Матезиус, К., Руд, Т., и Сандерс, К. (2012) Описание, вывод, способ действия и знакомство с GM-HRA Фермент. Номер исследования: PHI-2012-020. Неопубликованное исследование подготовлено Pioneer Hi-bred International, Inc., 25 июня 2012 г. 22 стр. MRID No.48872003.

14. US-FDA (2007a) Консультационная записка по биотехнологии к файлу BNF № 000108. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, http://www.fda.gov/ Food / Biotechnology / Submissions / ucm155604.htm .

15. US-FDA (2009a) Консультационная записка по биотехнологии к файлу BNF № 000110. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, http://www.fda.gov/ Food / Biotechnology / Submissions / ucm155595.htm .

16.US-FDA (2007b) Ответное письмо Биотехнологического консультационного агентства BNF № 000108. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, http://www.fda.gov/ Food / Biotechnology / Submissions / ucm155575.htm.

17. US-FDA (2009b) Ответное письмо консультационного агентства по биотехнологиям BNF № 000110. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, http://www.fda.gov/ Food / Biotechnology / Submissions / ucm155567.htm.

X. Обзоры законодательных и исполнительных распоряжений

Это последнее правило устанавливает терпимость в соответствии с разделом 408 (d) FFDCA в ответ на петицию, поданную в Агентство.Управление по вопросам управления и бюджета (OMB) освободило эти типы действий от проверки в соответствии с исполнительным распоряжением 12866, озаглавленным «Регулирующее планирование и анализ» (58 FR 51735, 4 октября 1993 г.). Поскольку это окончательное правило не подлежит пересмотру в соответствии с Правительственным указом 12866, оно не подлежит рассмотрению согласно Правительственному распоряжению 13211, озаглавленному «Действия в отношении нормативных требований, которые существенно влияют на поставку, распределение или использование энергии» (66 FR 28355, 22 мая 2001 г. ) или Распоряжение 13045, озаглавленное «Защита детей от рисков для здоровья и безопасности окружающей среды» (62 FR 19885, 23 апреля 1997 г.).Это окончательное правило не содержит каких-либо сборников информации, подлежащих утверждению OMB в соответствии с Законом о сокращении документооборота (PRA), 44 U.S.C. 3501 et seq., , а также не требует каких-либо особых соображений в соответствии с Указом Президента 12898, озаглавленным «Федеральные меры по обеспечению экологической справедливости в отношении меньшинств и населения с низкими доходами» (59 FR 7629, 16 февраля 1994 г.).

Поскольку допуски и исключения, которые устанавливаются на основании петиции в соответствии с разделом 408 (d) FFDCA, такие как допуск в этом окончательном правиле, не требуют выпуска предлагаемого правила, требования Закона о гибкости регулирования (RFA) ) (5 ед.S.C. 601 et seq. ), не применяются.

Это последнее правило напрямую регулирует производителей, переработчиков пищевых продуктов, обработчиков пищевых продуктов и розничных продавцов продуктов питания, а не штаты или племена, и это действие не меняет взаимоотношений или распределения власти и ответственности, установленных Конгрессом в преимущественных положениях раздела 408 (n) FFDCA. (4). Таким образом, Агентство определило, что это действие не окажет существенного прямого воздействия на правительства штатов или племен, на отношения между национальным правительством и правительствами штатов или племен, или на распределение власти и ответственности между различными уровнями власти. правительство или между федеральным правительством и индейскими племенами.Таким образом, Агентство установило, что Исполнительный указ 13132, озаглавленный «Федерализм» (64 FR 43255, 10 августа 1999 г.), и Исполнительный указ 13175, озаглавленный «Консультации и координация с правительствами индейских племен» (65 FR 67249, 9 ноября 2000 г.) не применяются к этому окончательному правилу. Кроме того, это окончательное правило не налагает никаких обязательных к исполнению обязанностей и не содержит каких-либо нефинансируемых полномочий, как описано в Разделе II Закона о реформе нефинансируемых мандатов 1995 г. (UMRA) (2 U.S.C.1501 et seq.).

Это действие не связано с какими-либо техническими стандартами, которые потребовали бы рассмотрения Агентством добровольных согласованных стандартов в соответствии с разделом 12 (d) Национального закона о передаче и развитии технологий 1995 года (NTTAA) (15 U.S.C.272 примечание).

XI. Закон о пересмотре Конгресса

В соответствии с Законом о пересмотре Конгресса (5 USC 801 и след. ) EPA представит отчет, содержащий это правило и другую необходимую информацию, в Сенат США, Палату представителей США и Генеральному контролеру США до до публикации правила в Федеральном реестре . Это действие не является «основным правилом», как это определено в 5 U.S.C. 804 (2).

Начальный список предметов
  • Охрана окружающей среды
  • Административная практика и порядок
  • Сельскохозяйственные товары
  • Пестициды и вредители
  • Требования к отчетности и ведению документации
Конец списка предметов Начать подпись

Дата: 17 января 2013 г.

Стивен Брэдбери,

Директор Управления программ по пестицидам.

Конец Подпись

Таким образом, глава I 40 CFR изменяется следующим образом:

Начальная часть Конечная часть Начало поправки, часть

1. Авторитетная ссылка для части 174 по-прежнему выглядит следующим образом:

Конец поправки. Авторитет запуска

21 U.S.C. 321 (q), 346a и 371.

Окончание полномочий Начало поправки, Часть

2.Добавить § 174.533 в подраздел W следующего содержания:

End Amendment Part

Glycine max — инертный ингредиент, устойчивый к гербицидам, ацетолактат-синтаза (GM-HRA); Освобождение от требования толерантности.

Остатки фермента Glycine max , устойчивого к гербицидам ацетолактатсинтазы (GM-HRA) в продуктах питания и кормах сои или на них, не подпадают под требование толерантности при использовании в качестве инертного защитного ингредиента в составе растений.

Конец дополнительной информации

[FR Док. 2013-02699 Поданный 2-7-13; 8:45]

КОД СЧЕТА 6560-50-P

Глицин — чистые инкапсуляции

Рекомендуемое применение: 3-6 капсул в день в разделенных дозах между приемами пищи.

Глицин — Глицин может играть важную роль в содействии здоровой детоксикации, поддерживая функцию печени и почек и поддерживая память.

Что это такое?

Глицин — простейшая аминокислота; его боковая цепь состоит всего одного атома водорода. Благодаря своей простоте он имеет только одну форму, а не две (l- или d-), как другие амино кислоты. Это аминокислота в большом количестве и не считается существенный. Однако добавка глицина имеет было показано, что поддерживает здоровую функцию почек и печени а также здоровье нервной системы. *

Использование глицина

Когнитивная поддержка: в исследованиях на животных и в небольших человеческое исследование, глицин продемонстрировал способность поддерживает память и умственную функцию.В другом человеке испытание, глицин, действующий как ингибирующая аминокислота, имел нейропротекторные эффекты. *

Поддержка детоксикации: исследования на животных показывают, что глицин играет защитную роль для почек и печени в частности, поддерживая детоксикацию некоторых химикаты. Также было показано, что глицин смягчает высвобождение цитокинов во время метаболического стресса. *

Что такое источник?

Глицин производится синтетически.Витамин С (аскорбил пальмитат) получают в результате ферментации кукурузной декстрозы. Гипоаллергенное растительное волокно получают из сосновой целлюлозы.

Есть ли возможные побочные эффекты или Меры предосторожности?

Глицин может быть противопоказан тем, кто сразу выздоравливает после инсульта или при заболеваниях печени и почек. Если беременным или кормящим, перед приемом проконсультируйтесь с врачом. этот продукт.

Есть ли потенциальные взаимодействия с наркотиками?

Глицин может быть противопоказан тем, кто принимает клозапин, антипсихотический препарат.

Факты о добавках:

Рекомендуемое использование: 3-6 капсул в день в разделенных дозах между приемами пищи.

Состав AMT % DV
глицин (свободная форма) 500 мг.
витамин С (в виде аскорбилпальмитата) 20 мг.

Другие ингредиенты: (гипоаллергенное растительное волокно добавлено для полного объема капсулы)

(-)% DV не указан или производитель не предоставил эти данные.

Есть вопросы об этом продукте?
Позвоните нам по телефону (888) 821-8808

Подключение к онлайн-системе здравоохранения:
У вас есть вопросы об этом продукте или вы хотите связаться с вашим поставщиком медицинских услуг? Мы рады предложить виртуальный визит. Станьте здоровее с виртуальным визитом!
Ваш лечащий врач сможет предоставить вам индивидуальные рекомендации по продукту, советы и эксклюзивные акции, которые помогут сэкономить на профессионально разработанных, высокоэффективных натуральных продуктах для здоровья, которых нет в магазинах.У вас нет учетной записи или вы хотите узнать больше о технологии Virtual Visit?
Зарегистрируйтесь здесь!

Глицин подавляет сигнальный путь AGE / RAGE и последующий окислительный стресс, восстанавливая функцию Glo1 в аорте диабетических крыс и в HUVEC.

Окислительный стресс играет решающую роль в патогенезе диабетических сосудистых осложнений. Известно, что накопление конечных продуктов гликирования (AGE) и активация рецептора AGE (RAGE) вызывают устойчивый окислительный стресс в ткани сосудов.Все больше данных указывает на то, что глицин, простейшая аминокислота, оказывает антиоксидантное и антигликационное действие, а также улучшает функцию сосудов. Однако механизм, посредством которого глицин защищает ткань сосудов от окислительного стресса на моделях с диабетом, не исследован. В настоящем исследовании мы оценили, может ли глицин ослаблять окислительный стресс путем подавления пути передачи сигналов AGE / RAGE в аорте крыс с индуцированным стрептозотоцином диабетом и в эндотелиальных клетках пупочных сосудов человека (HUVEC).Наши результаты показали, что пероральное введение глицина увеличивает содержание NO и снижает окислительный стресс в сыворотке и аорте крыс с диабетом. Путь передачи сигналов AGE / RAGE в аорте крыс с диабетом был значительно ослаблен обработкой глицином, что проявлялось в снижении уровней AGE, RAGE, Nox4 и NF- κ B p65. Подавляющее действие глицина на образование AGE было связано с повышенной активностью и экспрессией аортальной глиоксалазы-1 (Glo1), важнейшего фермента, разрушающего метилглиоксаль (MG), основного предшественника AGE.В обработанных MG HUVEC глицин восстанавливает функцию Glo1, подавляет сигнальный путь AGE / RAGE и ингибирует образование активных форм кислорода. Кроме того, снижение образования AGE в HUVEC, вызванное обработкой глицином, ингибировалось ингибированием Glo1. В совокупности наше исследование предоставляет доказательства того, что глицин может ингибировать путь AGE / RAGE и последующий окислительный стресс за счет улучшения функции Glo1, тем самым защищая от диабетических макрососудистых осложнений.

1.Введение

Сосудистые осложнения стали ведущей причиной заболеваемости и смертности среди пациентов, страдающих сахарным диабетом во всем мире. Окислительный стресс играет центральную роль в патогенезе сосудистых осложнений диабета [1]. Хорошо известно, что образование конечных продуктов гликирования (AGE) и последующий сигнальный путь вносят основной вклад в стойкий окислительный стресс, который возникает в ткани сосудов [2, 3]. AGE образуются в результате неферментативных реакций между восстанавливающими сахарами и аминогруппами больших биомолекул, включая белки, нуклеиновые кислоты и липиды [4].Этот необратимый процесс ускоряется при хронической гипергликемии и / или окислительном стрессе, как при сахарном диабете. Помимо депонирования во внеклеточном матриксе и рекрутирования макрофагов в сосуды [5], AGE также связываются с рецептором AGE (RAGE) и активируют НАДФН-оксидазу (Nox) и NF- κ B [6], таким образом инициируя порочный круг окислительного стресса и воспаления [7, 8]. Еще одна вредная особенность AGE — их роль в «метаболической памяти». Поскольку образование AGE не может быть обращено вспять, их накопление в сосудистой ткани вызывает устойчивый окислительный стресс, даже если гипергликемия уменьшается [9].Следовательно, поиск способов ингибирования образования AGE имеет особое значение для защиты от окислительного стресса при диабетическом сосудистом повреждении.

Метилглиоксаль (MG), высокореактивный дикарбонильный метаболит гликолиза, все больше признается в качестве основного предшественника внутриклеточных AGE [10]. MG разлагается глиоксалазной системой, эффективной системой ферментативной детоксикации, в которой глиоксалаза-1 (Glo1) является ферментом, ограничивающим скорость [11]. Используя глутатион (GSH) в качестве кофактора, Glo1 превращает MG в промежуточный продукт, который далее детоксифицируется в лактат глиоксалазой-2.В условиях диабета снижается как экспрессия Glo1, так и уровни GSH [12–14]. Следовательно, функция Glo1 нарушается, что приводит к неконтролируемому образованию AGE и окислительному стрессу [15, 16]. Следовательно, усиление функции Glo1 может сыграть ценную роль в подавлении этого вредного процесса.

Глицин — простейшая аминокислота у млекопитающих. Помимо участия в синтезе структурных биомолекул, глицин является одним из предшественников GSH, одного из важнейших антиоксидантов в организме человека.При диабетических осложнениях глицин оказывает подавляющее действие на гликирование, такое как задержка образования катаракты [17], хотя механизм этого четко не установлен. В недавних исследованиях сообщалось о некоторых защитных эффектах глицина при повреждениях сосудов, таких как улучшение функции эндотелия [18] и восстановление реактивности сосудов [13], но влияние глицина на крупные кровеносные сосуды, подверженные диабетическим состояниям, не исследовалось. Антигликационные и антиоксидантные эффекты глицина оставляют открытой возможность того, что глицин может работать, подавляя образование AGE и ингибируя активацию оси AGE / RAGE, тем самым защищая от окислительного стресса и диабетических сосудистых осложнений.В связи с действием глицина на восстановление уровня GSH в сосудах [13], мы предположили, что глицин может оказывать благотворное влияние на функцию Glo1, тем самым восстанавливая способность Glo1 ингибировать образование AGE.

В настоящем исследовании мы стремились изучить влияние глицина на сигнальный путь AGE / RAGE, а также на функцию Glo1 в аорте крыс с диабетом и в эндотелиальных клетках пупочных сосудов человека (HUVEC). Наша цель состояла в том, чтобы увеличить количество возможных терапевтических методов, которые могут быть полезны при диабетических макрососудистых осложнениях.

2. Материалы и методы
2.1. Экспериментальные животные

Все протоколы и процедуры нашего исследования были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных факультета Первой больницы Пекинского университета (номер разрешения: J201613).

Шестинедельных самцов крыс Sprague-Dawley (SD) содержали при 12-часовом цикле свет-темнота. Все животные имели неограниченный доступ к питьевой воде и питанию. После двух недель акклиматизации всех крыс случайным образом распределили либо в экспериментальную группу, либо в здоровую контрольную группу.После ночного голодания экспериментальной группе внутрибрюшинно вводили разовую дозу стрептозотоцина (STZ, 45 мг / кг веса тела, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Сахарный диабет (СД) был подтвержден через 2 недели путем измерения уровня глюкозы в крови (пациенты с сахарным диабетом были подтверждены как диабетики). Экспериментальная группа была далее разделена на группу DM (нелеченные диабетические крысы, получавшие обычную питьевую воду) и группу DG (диабетические крысы, получавшие 1% (/) глицин ad libitum в питьевой воде [13, 19],).Аналогичным образом, здоровая контрольная группа была разделена на две группы: контрольную группу (здоровые крысы, получавшие обычную питьевую воду) и группу CG (здоровые крысы, получавшие 1% (/) глицин ad libitum в питьевой воде). Через 12 недель всех крыс анестезировали пентобарбиталом и умерщвляли. Грудные аорты быстро удаляли и хранили при -80 ° C или погружали в формалин для фиксации. Образцы сыворотки были собраны для определения биохимического профиля (с помощью автоматического биохимического анализатора 7600, Hitachi, Токио, Япония) и концентрации глицина.

2.2. Измерение сывороточного глицина

Образцы сыворотки готовили с использованием набора для анализа свободных аминокислот EZ: faast GCMS (Phenomenex, Торранс, Калифорния, США) и анализировали на газовом хроматографе-масс-спектрометре-QP2010 (Shimadzu, Киото, Япония) в соответствии с инструкции производителя. Условия были следующими: образцы вводили с использованием раздельного впрыска в соотношении 1:10 и температуре порта 280 ° C. Колонку Rtx-5MS () использовали для разделения соединений. Первоначальная температура печи была установлена ​​на уровне 100 ° C, затем повышена до 300 ° C со скоростью 10 ° C / мин и затем выдержана в течение 10 минут.

2.3. Гистопатология

Нисходящие грудные аорты фиксировали в 10% формалине, заливали парафином и разрезали на 4 среза по мкм. Регидратированные срезы окрашивали гематоксилин-эозином (H&E) для наблюдения общих изменений и измерения толщины интима-медиа (IMT). Пять случайных неперекрывающихся полей зрения одного среза были захвачены на микроскопе Olympus DP71 (увеличение 400x). В каждом поле зрения IMT измеряли в четырех разных точках с помощью программного обеспечения ImageJ.Набор для окрашивания Verhoeff-Van Gieson (DC0059, Leagene, Beijing, China) использовался для наблюдения за эластичными волокнами в ткани.

2.4. Измерение концентрации NO и маркеров окислительного стресса в сыворотке и аорте

Образцы аорты обрабатывали ультразвуком в ледяном буфере для лизиса RIPA (P0013, Beyotime, Шанхай, Китай) и центрифугировали при 16000 g в течение 20 минут при 4 ° C. . Концентрации белка определяли с помощью набора Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Hudson, NH, USA) и доводили до тех же уровней.Для определения уровней метаболитов NO (S0021, Beyotime, Шанхай, Китай), общих уровней GSH (S0053, Beyotime, Шанхай, Китай), уровней малонового диальдегида (MDA) (S0131, Beyotime, Шанхай, Китай) и активности супероксиддисмутазы (SOD) (706002, Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, USA) в соответствии с инструкциями производителей.

2,5. Измерение уровней AGE

100 мкл мкл образцов солюбилизированного белка вносили пипеткой в ​​лунки 96-луночного непрозрачного планшета и оценивали автофлуоресценцию AGE при длинах волн Ex 370 нм / Em 440 нм [20].Набор AGE ELISA (MBS261131, MyBioSource, Сан-Диего, Калифорния, США) также применяли для определения концентраций AGE в соответствии с инструкциями производителя. Данные были нормализованы по концентрациям белка.

2.6. Иммуногистология

Мы следовали методам Wang et al. [21]. После блокирования срезы аорты инкубировали в течение ночи при 4 ° C с кроличьими антителами против AGE (1: 200, ab23722, Abcam, Кембридж, Великобритания), кроличьими антителами против RAGE (1: 200, ab3611, Abcam, Кембридж, Великобритания). Великобритания), кроличьи антитела против Nox4 (1: 150, ab133303, Abcam, Кембридж, Великобритания), мышиные антитела против 3-нитротирозина (1: 200, ab61392, Abcam, Кембридж, Великобритания), кроличьи антитела против NF- κ B p65 антитело (1: 200, D14E12, CST, Беверли, Массачусетс, США) или мышиное антитело против Glo1 (1: 200, MA1-13029, Invitrogen, Waltham, MA, США).Срезы промывали и затем инкубировали со вторичным антителом (1: 200, конъюгированное с пероксидазой антитело против кролика (ZB-2301) или антитело против мыши (ZB-2305), ZSGB-BIO, Пекин, Китай) в течение 1 часа. Цвет был разработан с использованием DAB. Изображения были получены с помощью микроскопа Olympus DP71. Среднее значение IOD окрашивания (IOD / площадь) из 5 случайных полей на одном срезе оценивалось с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus 6.0.

2.7. Вестерн-блот

Образцы солюбилизированного белка кипятили с загрузочным буфером в течение 5 мин.Равные количества белка (30 мкл г) разделяли с помощью электрофореза в 12% SDS-полиакриламидном геле и переносили электропереносом на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком и инкубировали с кроличьими антителами против RAGE (1: 1000, ab3611, Abcam, Кембридж, Великобритания), кроличьими антителами против Nox4 (1: 1000, ab133303, Abcam, Кембридж, Великобритания). , кроличьи антитела против NF- κ B p65 (1: 1000, D14E12, CST, Беверли, Массачусетс, США) или мышиные антитела против Glo1 (1: 3000, MA1-13029, Invitrogen, Waltham, MA, USA) ) в течение ночи при 4 ° C.После тщательной промывки мембрану инкубировали со вторичными антителами (1: 5000, конъюгированные с пероксидазой антикроличьи (ZB-2301) или антимышиные (ZB-2305) антитела, ZSGB-BIO, Пекин, Китай) для получения час при комнатной температуре. β -Актин использовали в качестве контроля загрузки (1: 3000 TA-09, ZSGB-BIO, Пекин, Китай). Полосы визуализировали с использованием субстрата для вестерн-блоттинга ECL (Thermo Fisher Scientific, Hudson, NH, USA) и количественно оценивали с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus 6.0.

2,8. Измерение активности Glo1

Активность Glo1 измеряли в соответствии с методом, установленным Arai et al.[22]. Образцы промывали PBS и обрабатывали ультразвуком в 10 мМ натрий-фосфатном буфере (). После центрифугирования с помощью набора BCA определяли концентрацию белка и доводили ее до одинакового уровня во всех образцах. В 96-луночном планшете 125 мкл мкл натрий-фосфатного буфера (100 мМ), 25 мкл мкл GSH (40 мМ), 25 мкл мкл MG (40 мМ) и 70 мкл мкл Millipore В каждую лунку добавляли воду и инкубировали при 37 ° C в течение 15 мин. После инкубации в каждую лунку добавляли 5 мкл мкл солюбилизированного белка из клеток или ткани аорты.Оптическую плотность при 240 нм () контролировали каждые 2 мин. Активность Glo1 отображалась как скорость изменения на мг белка.

2.9. Культура клеток и жизнеспособность

Линия эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) была куплена у Китайской национальной инфраструктуры ресурсов клеточных линий. HUVEC культивировали в минимально необходимых средах (MEM без глицина, глюкоза 5,5 мМ, Hyclone, Life Science, Питтсбург, Пенсильвания, США) с 10% фетальной бычьей сывороткой (Gibco, Life Science, Питтсбург, Пенсильвания, США), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкл г / мл стрептомицина при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 .HUVEC были идентифицированы по их типичной морфологии булыжника и наличию антигена фактора фон Виллебранда (VWF).

Жизнеспособность клеток оценивали с использованием CCK-8 (Cell Counting Kit-8, Donjindo, Mashikimachi, Japan). HUVEC засевали в каждую лунку 96-луночного планшета. После обработки каждую лунку осторожно промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), чтобы исключить возможное влияние любой оставшейся культуральной среды. В каждую лунку добавляли 10 мкл мкл раствора CCK-8 и 100 мкл мкл новой среды MEM без фенолового красного.После инкубации при 37 ° C в течение 3 часов измеряли оптическую плотность при 450 нм.

2.10. Иммунофлуоресценция

HUVEC засевали на покровное стекло, помещенное в лунку 12-луночного планшета. После обработки все куски покровного стекла инкубировали в 10% нейтральном формалине в течение 10 минут, промывали 3 раза PBS и инкубировали с 0,1% реагентом Triton X-100 в течение 10 минут. Затем клетки блокировали в 1% BSA в течение 30 минут и инкубировали с 50 мкл мкл кроличьих антител против AGE (1: 200, ab23722, Abcam, Cambridge, UK) в течение ночи при 4 ° C.После обширной промывки в PBS клетки инкубировали с флуоресцентным вторичным антителом в течение часа в темной камере. После трехкратной промывки покровное стекло было установлено с помощью DAPI. Цифровые изображения флуоресцентного окрашивания были получены на микроскопе Olympus. Пять случайных неперекрывающихся полей зрения одной секции были захвачены для расчета средней интенсивности флуоресценции.

2.11. Оценка внутриклеточных активных форм кислорода (ROS)

Внутриклеточные ROS оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием чувствительного к окислению флуоресцентного зонда (2,7-дихлорфлуоресцина диацетат, DCFH-DA, D6883, Sigma-Aldrich, St.Луис, Миссури, США). Обработанные клетки осторожно промывали PBS и инкубировали с DCFH-DA (10 мкМ M в MEM без фенолового красного). Через 30 минут клетки промывали 3 раза PBS и расщепляли 0,05% трипсин-ЭДТА. Средние интенсивности флуоресценции Ex 488 / Em 525 определяли с помощью проточной цитометрии.

2.12. Статистический анализ

Статистический анализ данных был выполнен с использованием SPSS 20.0 (SPSS Inc., Чикаго, США) по методам, опубликованным в другом месте [21].Количественные данные представлены как ошибки средних (для нормально распределенных данных) или медианы и межквартильные диапазоны (для ненормально распределенных данных). Различия между группами оценивали с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) для нормально распределенных данных с последующим апостериорным тестом Тьюки. Кроме того, для ненормально распределенных данных использовался тест Краскела-Уоллиса. Значение менее 0,05 считалось значимым.

3. Результаты
3.1. Влияние глицина на уровень глюкозы в плазме, массу тела и уровни глицина в сыворотке

На 12 неделе уровни глюкозы в плазме в группе DM были значительно выше, чем в контрольной группе (Таблица 1).Масса тела и уровни глицина в сыворотке крови в группе DM были ниже, чем в контрольной группе (и, соответственно). По сравнению с группой DM, уровни глюкозы и масса тела в группе DG, казалось, не пострадали, тогда как уровни глицина в сыворотке были значительно увеличены ().

38

Контроль CG DM DG

Масса тела (г)
Сывороточный глицин ( μ M) ###
Контроль: здоровые крысы, получавшие обычную водопроводную воду.CG: здоровые крысы, получавшие водопроводную воду с добавлением 1% глицина. DM: диабетические крысы, получавшие обычную водопроводную воду. DG: диабетические крысы, получавшие водопроводную воду с добавлением 1% глицина. -8. , по сравнению с контрольной группой. по сравнению с группой DM.
3.2. Влияние лечения глицином на гистопатологию аорты и функцию сосудов

Чтобы оценить влияние лечения глицином на структуру ткани аорты, мы применили окрашивание H&E и Verhoeff-Van Gieson для изучения морфологических изменений.Окрашивание H&E (рис. 1 (а)) показало, что в группе DM как интимный, так и медиальный слои аорты были дезорганизованы, тогда как в группе DG наблюдалось гораздо меньше повреждений. Окрашивание Верхоффа-Ван Гизона (рис. 1 (b)) продемонстрировало, что эластичные волокна в группе DM демонстрировали серьезную фрагментацию и деформацию. При лечении глицином деформация эластиновых волокон была ниже, чем в группе DM, хотя и не восстановилась полностью.

Чтобы оценить влияние глицина на функцию эндотелиальных сосудов, мы измерили уровни метаболитов NO в сыворотке и аорте.Рисунки 1 (c) и 1 (d) показывают, что в группе DM концентрации метаболитов NO были значительно снижены как в сыворотке, так и в гомогенатах ткани аорты по сравнению с контрольной группой (и, соответственно). В группе DG концентрации метаболитов NO были значительно повышены по сравнению с этими концентрациями в группе DM (). Как показано на Рисунке 1 (e), между четырьмя группами не наблюдалось значительных различий в IMT аорты.

3.3. Глицин увеличивает антиоксидантную способность сыворотки диабетических крыс

Чтобы оценить влияние глицина на антиоксидантную способность, мы измерили уровни GSH, SOD и MDA в сыворотке и аорте крыс.В сыворотке уровни GSH и SOD в группе DM были значительно снижены по сравнению с контрольной группой (и, соответственно, фиг. 2 (a) и 2 (b)). Однако уровни GSH были значительно увеличены в группе DG по сравнению с группой DM (). Уровни SOD в группе DG имели тенденцию к повышению, но эта тенденция не достигла статистической значимости. Уровни MDA в сыворотке в группе DM были увеличены по сравнению с таковыми в контрольной группе (рис. 2 (c)), но это повышение было отменено в группе DG ().Никаких изменений этих маркеров в группе КГ не наблюдалось.

3.4. Глицин восстанавливает антиоксидантный статус в аорте диабетических крыс

В гомогенатах ткани аорты диабет значительно снижает уровни GSH и SOD по сравнению с контрольной группой (и, соответственно, рисунками 2 (d) и 2 (e)), тогда как Обработка глицином значительно увеличила эти два антиоксидантных маркера (и, соответственно). Уровни MDA в аорте были увеличены в группе DM по сравнению с контрольной группой ().При обработке глицином уровни MDA у диабетических крыс были снижены (рис. 2 (f)). Явных изменений в группе CG по сравнению с контрольной группой не обнаружено. Как показала иммуногистология (Рисунки 2 (g) и 2 (h)), экспрессия 3-нитротирозина в аорте была значительно увеличена в группе DM по сравнению с контрольной группой (), особенно в интимном слое. Однако группа DG показала гораздо меньшее окрашивание 3-нитротирозина ().

3.5. Глицин подавляет накопление AGE и сигнальный путь RAGE-Nox-NF-
κ B

Хорошо известно, что AGE связывается со своим рецептором RAGE, который дополнительно активирует NADPH-оксидазу (Nox) [23] и воспалительную реакцию [24], в конечном итоге вызывая замкнутую петлю окислительного стресса в сосудистой ткани [2, 5].Таким образом, сигнальный путь AGE / RAGE представляет собой один из основных механизмов оксидативного стресса сосудов. Сообщалось, что добавка глицина может снизить уровень AGE в сыворотке диабетических крыс [17], но его влияние на сосудистую ткань остается неизвестным. Чтобы выяснить, был ли антиоксидантный эффект глицина связан с подавлением пути AGE / RAGE, мы измерили экспрессию AGE, RAGE, Nox4 и NF- κ B p65. Уровни сывороточного AGE в группе DM были значительно увеличены по сравнению с таковыми в контрольной группе (Фигуры 3 (a) и 3 (b)).Обработка глицином снижала уровни AGE в сыворотке, что определялось как с помощью автофлуоресценции, так и с помощью ELISA (и, соответственно). Аналогичным образом, уровни AGE в аорте были увеличены в группе DM, как обнаружено с помощью иммуногистологического анализа (фиг. 3 (c) и 3 (d)), но были снижены в группе DG (). Аналогичные результаты были также получены при измерении AGE в аорте с помощью ELISA (рис. 3 (е)).

Чтобы исследовать, может ли индуцированное глицином снижение AGE влиять на нижестоящий путь передачи сигналов AGE / RAGE, мы применили иммуногистологию и иммуноблоты для определения экспрессии RAGE, Nox4 и NF- κ B p65 в аорте.Как показано на рисунках 3 (f) –3 (n), экспрессия аортального RAGE, Nox4 и NF- κ B p65 значительно увеличилась в группе DM по сравнению с контрольной группой (,, и, соответственно) в вестерн-блоттинг. Однако экспрессия RAGE, Nox4 и NF- κ B в группе DG была значительно снижена по сравнению с таковой в группе DM (,, и, соответственно). Аналогичные результаты наблюдались и при иммуногистологическом анализе. Не было замечено значительных различий в группе CG по сравнению с контрольной группой.

3,6. Глицин увеличивает активность Glo1 аорты и экспрессию белка

Чтобы выяснить, является ли подавляющий эффект глицина на образование AGE следствием активации системы Glo1, мы измерили активность и экспрессию белка Glo1 аорты. Как показано в иммуногистологическом анализе (рисунки 4 (a) и 4 (b)), в группе DM наблюдалась гораздо меньшая экспрессия Glo1, чем в контрольной группе (), тогда как более высокий уровень окрашивания Glo1 был показан в группе DM. Группа DG, чем в группе DM ().Как показано на фиг. 4 (c) и 4 (d), экспрессия и активность аортального Glo1 были значительно ниже в группе DM, чем в контрольной группе (). Однако как экспрессия, так и активность белка Glo1 были заметно увеличены в группе DG по сравнению с группой DM ().

3,7. Глицин восстанавливает жизнеспособность и функцию Glo1 в обработанных MG HUVEC

Чтобы исследовать, опосредовано ли подавление образования AGE и нижестоящего сигнального пути AGE / RAGE, вызванного обработкой глицином, с помощью Glo1, мы изучили HUVEC.Мы добавили 400 мкг M MG в среду для выращивания HUVEC для имитации дикарбонильного стресса, вызванного гипергликемией. Во время 72-часовой инкубации с MG некоторые из HUVEC также обрабатывали 0,5 мМ, 2 мМ или 4 мМ глицином. Как показано на рисунке 5 (а), жизнеспособность клеток упала на 35% при обработке MG в течение 72 часов (). И 2 мМ, и 4 мМ глицин защищали от повреждений, вызванных MG (). Обработка 0,5 мМ глицина не оказала очевидного влияния на жизнеспособность клеток.

Инкубация HUVEC с MG вызвала значительное снижение внутриклеточного соотношения GSH / GSSG по сравнению с контрольной группой (, Рисунок 5 (b)), но это снижение было обращено обработкой 2 мМ и 4 мМ глицином ().

Инкубация HUVEC с MG также вызвала значительное снижение активности клеточного Glo1 по сравнению с контрольной группой (). Как показано на Фигуре 5 (c), обработка глицином 2 мМ и 4 мМ значительно повышала активность Glo1 дозозависимым образом (и, соответственно). Не было обнаружено заметных изменений этих параметров в клетках, обработанных 0,5 мМ глицином.

3.8. Глицин ингибирует клеточное образование AGE и сигнальный путь RAGE-Nox-NF-
κ B в MG-обработанных HUVEC

Чтобы исследовать, может ли благоприятное влияние глицина на функцию Glo1 влиять на образование AGE и последующий путь AGE / RAGE, мы определили уровни AGE, RAGE, Nox4 и NF-κB p65 в обработанных MG HUVEC.Как показано на фиг. 6 (a) и 6 (c), инкубация HUVEC с MG в течение 72 часов значительно увеличивала образование AGE, что отражалось в иммунофлуоресцентном анализе и ELISA (и, соответственно). Исследование иммунофлуоресценции показало, что экспрессия AGE снижалась на 0,5 мМ, 2 мМ или 4 мМ глицина (,, и, соответственно), тогда как анализ ELISA показал, что только обработка 4 мМ глицином может значительно обратить вспять увеличение образования AGE. ().

Как показано на фиг. 6 (d) и 6 (f), уровни экспрессии RAGE, Nox4 и NF- κ B p65 в HUVEC были значительно увеличены при обработке MG в течение 72 часов ().Однако обработка 2 мМ или 4 мМ глицина значительно снижала уровни экспрессии RAGE (), Nox4 () и NF- κ B p65 (). Обработка 0,5 мМ глицина была эффективна только в подавлении клеточной экспрессии Nox4 ().

3.9. Обработка глицином снижает образование внутриклеточных ROS

Анализ проточной цитометрии показал, что после инкубации с MG в течение 72 часов внутриклеточная флуоресценция DCFH-DA, которая служит инструментом приблизительной оценки внутриклеточных ROS, была значительно увеличена на 50% по сравнению с контролем. группа (, Рисунки 6 (g) и 6 (h)).Однако при обработке 0,5 мМ, 2 мМ или 4 мМ глицина индуцированные MG сигналы флуоресценции DCFH-DA были значительно уменьшены (, и, соответственно).

3.10. Защитные эффекты глицина в подавлении образования AGE опосредуются Glo1

Чтобы выяснить, опосредуется ли влияние глицина на супрессию AGE через Glo1, мы совместно обрабатывали HUVEC с помощью 4 мкг M ингибитора Glo1 S-бромбензилглутатиона циклопентил-диэфира (BBC). глицин в течение 72 ч. Наши результаты показали, что увеличение активности Glo1 за счет глицина было уменьшено (по сравнению с контролем, рис. 7 (а)).Кроме того, подавляющее действие глицина на образование AGE блокировалось BBGC (по сравнению с контролем, фиг. 7 (b)).

4. Обсуждение

Окислительный стресс играет центральную роль в патогенезе диабетических сосудистых осложнений. Глицин является предшественником синтеза GSH и, как известно, оказывает антиоксидантное действие на моделях диабетических осложнений [17, 19, 25–27]. Исследования показали роль глицина в восстановлении функции эндотелия сосудов у старых крыс [18] и у крыс с метаболическим синдромом [13], но влияние глицина на макроваскулярные повреждения, вызванные диабетом, и возможные механизмы любого такого эффекта все еще остаются неясными. .В настоящем исследовании мы обнаружили, что структурные нарушения в аорте крыс с диабетом, такие как деформация эластических волокон, заметно улучшались при лечении глицином. Кроме того, пониженные уровни метаболитов NO в сыворотке крови и гомогенатах аорты крыс с диабетом восстанавливались глицином, что позволяет предположить, что функция сосудов улучшалась обработкой глицином. Поскольку окислительный стресс может инактивировать NO [28] и привести к повреждению сосудов, мы предположили, что глицин может защищать сосудистую ткань, уменьшая окислительный стресс.

Несмотря на то, что в питательном отношении глицин не является существенным, сообщалось о его недостаточности как у пациентов с предиабетом, так и у пациентов с установленным диабетом [29, 30]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что уровни глицина в сыворотке крови в группе DM были снижены по сравнению с таковыми в контрольной группе, тогда как уровни глицина в группе DM были значительно увеличены по сравнению с таковыми в группе DM. В нормальных условиях сывороточный уровень глицина у человека колеблется от 200 до 400 мкМ М [26].После лечения глицином уровень глицина у людей может даже вырасти до 942 мк M, но не вызвать побочных эффектов [31]. В нашем исследовании средний уровень глицина в сыворотке здоровых крыс составляет около 54% ​​от уровня глицина в сыворотке здоровых людей, о котором сообщают Sekhar et al. () [12], но схож с уровнем глицина у здоровых людей, о котором сообщают Tulipani et al. () [29]. Хотя концентрации глицина могут различаться между моделями крыс и людьми, существенные исследования показали, что у субъектов с диабетом или метаболическим синдромом уровни глицина снижаются по сравнению со здоровыми субъектами, но это снижение может быть отменено пероральным лечением глицином. [12, 13, 29, 32].

Параллельно со снижением уровней глицина в группе DM, уровни GSH в сыворотке и гомогенатах аорты в этой группе были снижены по сравнению с таковыми в контрольной группе, но были значительно увеличены в группе DG. Глицин также снижает уровень MDA в сыворотке и имеет тенденцию улучшать активность SOD в сыворотке у крыс с диабетом. Глицин также значительно улучшил активность СОД и снизил уровни МДА и 3-нитротирозина в гомогенатах аорты. МДА является конечным продуктом перекисного окисления липидов, вызванного образованием АФК, а 3-нитротирозин служит маркером пероксинитрита, вызванного окислительным стрессом.Снижение этих окислительных биомаркеров у крыс с диабетом при лечении глицином показало, что окислительный стресс, вызванный сахарным диабетом, заметно уменьшился к 12 неделям перорального лечения глицином.

Сообщалось, что AGE и нижестоящий путь передачи сигналов AGE / RAGE представляют собой основные механизмы оксидативного стресса сосудов [5, 33]. Образование AGE является неферментативным и необратимым, и многие такие реакции гликирования специфически происходят на долгоживущих макромолекулах, таких как коллаген [34], который обнаруживается в высоких концентрациях в стенках сосудов.После образования AGE не только накапливаются в сосудистой ткани, вызывая морфологические аномалии, но также активируют нижестоящий путь RAGE-Nox-NF- κ B и вызывают устойчивый окислительный стресс [7, 23]. Окислительный стресс, вызванный гипергликемией, может, в свою очередь, усугубить накопление AGE и экспрессию RAGE [1, 16], тем самым создавая порочный круг, который приведет к постоянному повреждению. Следовательно, подавление образования AGE и окислительного стресса имеет решающее значение для предотвращения диабетических сосудистых осложнений.

Чтобы изучить, уменьшает ли глицин окислительный стресс посредством вмешательства оси AGE / RAGE, мы оценили влияние глицина на экспрессию AGE и нижестоящий путь AGE / RAGE. Уровни AGE в сыворотке и аорте диабетических крыс были значительно выше по сравнению с таковыми у здоровых контрольных крыс, но были значительно ниже у диабетических крыс, получавших лечение глицином. Между тем, уровни экспрессии RAGE, Nox4 и NF- κ B в аорте диабетических крыс были заметно увеличены по сравнению с таковыми в контрольной группе, но это повышение подавлялось обработкой глицином.Эти результаты продемонстрировали, что обработка глицином значительно ингибировала путь AGE / RAGE, тем самым ослабляя оксидативный стресс сосудов. Nox4 вносит основной вклад в генерацию сосудистых АФК [35, 36]. Снижение экспрессии аортального Nox4 в группе DG нашего исследования предполагает, что помимо участия в синтезе GSH, глицин также может работать, подавляя экспрессию окислительных ферментов. Этот результат также согласуется с нашим предыдущим исследованием, в котором сообщалось о влиянии перорального лечения глицином на подавление экспрессии островка p22 phox и окислительных маркеров на моделях диабетических крыс [37].Кроме того, недавно мы сообщили, что 20-недельное лечение глицином снизило уровни мРНК и белка Nox4 и улучшило антиоксидантную защиту в почках крыс с STZ-индуцированным диабетом [21]. Однако в этом исследовании предшествующий механизм, посредством которого глицин регулирует почечный Nox4, не исследовался. Основываясь на результатах настоящего исследования, есть соблазн предположить, что снижение Nox4 может быть результатом подавляющего действия глицина на экспрессию AGE и RAGE.

Эффект глицина на подавление образования AGE в аорте в нашем исследовании представляет особый интерес. Насколько нам известно, это первое исследование, которое доказывает, что глицин может ослаблять образование AGE в сосудистой ткани. Сообщалось, что некоторые биоактивные антиоксиданты, такие как урсоловая кислота [38] и кемпферол [39], могут подавлять образование AGE и снижать экспрессию белков оси AGE / RAGE, тем самым защищая от окислительного стресса и диабетических сосудистых повреждений.В предыдущих исследованиях сообщалось, что глицин может ингибировать индуцированное глюкозой гликирование в хрусталике, действуя как поглотитель глюкозы [27, 40], в то время как в другом исследовании предполагалось, что этот положительный эффект может быть связан с высокой растворимостью глицина, предотвращающим преципитацию AGE [ 41]. Тем не менее, молекулярные механизмы, посредством которых глицин подавляет образование AGE, четко не выяснены.

MG, высокореакционноспособное дикарбонильное соединение, все больше признается в качестве очень важного предшественника образования AGE [42].AGE, происходящие из MG, могут связываться с RAGE с высокой аффинностью и специфичностью [43], таким образом, более эффективно активируя ось AGE / RAGE. С традиционной точки зрения, процесс образования AGE — это медленная реакция между большими биомолекулами и восстанавливающими сахарами, такими как глюкоза, но недавние исследования показали, что MG в 200-20 000 раз более активен в образовании AGE, чем глюкоза [44, 45] . Используя GSH в качестве кофактора, Glo1 эффективно детоксифицирует MG, тем самым предотвращая образование AGE. GSH является критически важным антиоксидантом в организме человека, но уровень GSH недостаточен у пациентов с диабетом из-за чрезмерного окислительного стресса [12, 46].Кроме того, сообщалось, что активность Glo1 in vivo пропорциональна клеточной концентрации GSH [11, 14]. Тот факт, что глицин увеличивает синтез GSH и подавляет образование AGE, в нашем исследовании привел нас к гипотезе о том, что глицин может оказывать благотворное влияние на функцию Glo1, тем самым защищая от образования AGE. Таким образом, мы измерили экспрессию и активность аортального Glo1. Наши результаты показали, что экспрессия и активность Glo1 в аорте были снижены в группе DM по сравнению с контрольной группой, что указывает на нарушение способности Glo1 деградировать MG.Снижение функции Glo1 также частично объясняет увеличение образования AGE у диабетических крыс. По сравнению с таковыми в группе DM, экспрессия и активность аортального Glo1 в группе DG были значительно увеличены. Следовательно, разумно предположить, что глицин может восстанавливать функцию Glo1 за счет увеличения уровней GSH и улучшения экспрессии и активности Glo1, тем самым ингибируя образование AGE и последующий окислительный стресс.

Чтобы подтвердить, что подавляющий эффект глицина на оси AGE / RAGE был связан с наблюдаемым улучшением функции Glo1, мы инкубировали HUVEC непосредственно с 400 мкг M MG в течение 72 часов, чтобы имитировать дикарбонильный стресс, вызванный гипергликемией.Наши результаты показали, что в HUVEC, обработанных MG, введение 4 мМ глицина значительно увеличивало активность Glo1, а также внутриклеточное соотношение GSH / GSSG, указывая на то, что функция Glo1 была восстановлена ​​обработкой глицином. Введение глицина также приводило к снижению образования клеточных AGE и значительному снижению уровней экспрессии нескольких белков нижнего пути передачи сигнала AGE / RAGE, включая RAGE, Nox4 и NF- κ B p65. Следовательно, внутриклеточный окислительный стресс, вызванный MG, был значительно ослаблен введением глицина.Кроме того, мы обнаружили, что ингибитор Glo1 BBGC значительно блокирует подавляющее действие глицина на образование AGE. Таким образом, наш эксперимент in vitro предоставил доказательства положительного воздействия глицина на предотвращение вызванной MG активации оси AGE / RAGE и последующего увеличения окислительного стресса.

Повреждение эндотелиальных клеток — раннее событие в развитии атеросклероза. Потеря внутриклеточного глутатиона связана с нарушением барьерной функции эндотелия [47].Равновесие между восстановленной формой глутатиона (GSH) и окисленной формой (GSSG) имеет решающее значение для поддержания клеточного окислительно-восстановительного статуса. Когда GSH окисляется для улавливания свободных радикалов, окисленный глутатион (GSSG) может быть повторно использован для регенерации GSH путем использования НАДФН в качестве кофактора. Однако при хроническом окислительном стрессе НАДФН потребляется полиольным путем, нарушая рециклинг глутатиона [1]. В нашем исследовании окислительный стресс, вызванный обработкой MG, заметно истощил восстановленную форму глутатиона (GSH) и увеличил содержание GSSG в HUVEC, тем самым уменьшив соотношение GSH / GSSG и, следовательно, нарушив функцию Glo1.Когда внутриклеточный GSSG приближается к цитотоксическому уровню, он может транспортироваться за пределы клеток [48], что в конечном итоге может привести к недостаточности общего содержания глутатиона из-за недоступности субстратов. Эта гипотеза подтверждается значительным снижением уровней общего глутатиона в сыворотке и гомогенатах ткани аорты крыс с диабетом в нашем исследовании. Однако в группе DG как общее содержание глутатиона in vivo , так и соотношение GSH / GSSG in vitro были значительно увеличены по сравнению с таковыми в группе DM.Этот эффект добавки глицина на поддержание равновесия GSH подтверждается другими исследованиями, в которых сообщалось, что пероральное лечение глицином восстанавливает нарушенные уровни GSH на моделях диабетического или метаболического синдрома [12, 13, 37]. Кроме того, глицин может даже быть фактором, ограничивающим скорость синтеза GSH в ткани, согласно исследованию Mohammed et al. [32], в которых подчеркивается роль глицина в поддержании антиоксидантной защиты.

Значительные доказательства показали, что экспрессия Glo1 может усиливаться биоактивными антиоксидантами [49–52].Хотя механизмы все еще остаются неясными, роль ядерной транслокации ядерного фактора erythroid-2-related factor 2 (Nrf2) получает все большее признание. Nrf2 представляет собой окислительно-восстановительный фактор транскрипции, который регулирует уровни экспрессии различных антиоксидантных ферментов, включая SOD, гемоксигеназу 1 и глутамилцистеинсинтетазу. Недавно сообщалось, что Nrf2 также связывается с элементами антиоксидантного ответа (ARE) в экзоне 1 Glo1 [53]. Следовательно, транслокация Nrf2 в ядро ​​может увеличивать экспрессию Glo1 и повышать его активность.Ранее мы обнаружили, что глицин может способствовать ядерной транслокации Nrf2 в почках диабетических крыс (неопубликованные данные), но влияние глицина на активацию Nrf2 в сосудистой ткани не исследовалось. Тем не менее, это оставляет открытой возможность того, что положительные эффекты глицина на функцию Glo1 сосудов могут быть приписаны ядерной транслокации Nrf2.

Это исследование действительно имеет некоторые ограничения. Уровни MG в разных группах в эксперименте на животных не измеряли; таким образом, прямая функция Glo1 в деградации MG не была определена.Таким образом, в эксперименте in vitr o мы напрямую инкубировали HUVEC с MG, чтобы исследовать влияние глицина на вызванное MG повреждение в сосудистых клетках, и подтвердили, что глицин способен защищать функцию Glo1. Более того, в нашем исследовании концентрации глицина, использованные в экспериментах с культурами клеток, были выше, чем уровни глицина, измеренные в сыворотке крови животных. В HUVEC мы начали с 0,5 мМ глицина, потому что эта концентрация была близка к средним уровням глицина в сыворотке, обнаруженным в группе DG эксперимента на животных.Однако 0,5 мМ глицина было недостаточно для защиты от повреждения клеток, вызванного MG. Следовательно, концентрация глицина была увеличена до 2 мМ и 4 мМ. Кроме того, в клеточных экспериментах мы использовали ингибитор Glo1 только для нарушения функции Glo1, что могло привести к неспецифическим эффектам. Нокдаун Glo1 с использованием siRNA обеспечит дополнение к исследованию ингибиторов и лучше продемонстрирует специфический механизм действия глицина на Glo1.

Таким образом, наше исследование продемонстрировало, что глицин ослабляет окислительный стресс в аорте диабетических крыс, ингибируя накопление AGE и последующий путь передачи сигнала RAGE-Nox-NF- κ B.Кроме того, положительный эффект глицина на подавление образования AGE может быть связан с увеличением активности Glo1 и синтеза GSH. Точный механизм, лежащий в основе роли глицина в защите от диабетических макрососудистых повреждений, все еще требует дальнейшего изучения, чтобы расширить варианты лечения, доступные для клинической практики.

Доступность данных

Данные, использованные для подтверждения выводов этого исследования, можно получить у соответствующего автора по запросу.

Раскрытие информации

Финансирующая организация не принимала участия в написании, редактировании, утверждении рукописи или принятии решения о публикации.

Конфликт интересов

У авторов нет конфликта интересов в отношении данной статьи.

Благодарности

Эта работа была поддержана при финансовой поддержке Клинических медицинских исследований Китайской медицинской ассоциации (номер гранта 13040700455), Китайской национальной программы ключевых исследований и разработок в течение 13-го пятилетнего плана (номера грантов 2016YFC1305401 и 2016YFC1305405) и Пекинской городской науки и технологический проект (номер гранта D17110000281701).Мы благодарим LetPub (http://www.letpub.com) за лингвистическую помощь при подготовке этой рукописи.

Аутокринная обратная связь глицин-инсулин усиливает секрецию инсулина β-клетками человека и нарушается при диабете 2 типа

Abstract

Секреция инсулина β-клетками островков поджелудочной железы имеет решающее значение для гомеостаза глюкозы. Нарушение секреции инсулина лежит в основе почти всех форм диабета, включая наиболее частую форму — диабет 2 типа (T2D). Контроль секреции инсулина сложен и зависит от циркулирующих питательных веществ, нервных импульсов и локальной передачи сигналов.В текущем исследовании мы изучили вклад глицина, аминокислоты и нейромедиатора, который активирует лиганд-зависимые токи Cl , в секрецию инсулина островками людей-доноров с СД2 и без него. Мы обнаружили, что островковые β-клетки человека экспрессируют рецепторы глицина (GlyR), особенно субъединицу GlyRα1 и изоформы переносчика глицина (GlyT) GlyT1 и GlyT2. β-клетки проявляют значительные индуцированные глицином токи Cl , которые способствуют деполяризации мембраны, проникновению Ca 2+ и секреции инсулина β-клетками от доноров без T2D.Однако экспрессия GlyRα1 и токи, индуцированные глицином, снижаются в β-клетках от доноров с T2D. Глицин активно очищается GlyT, экспрессируемым в β-клетках, которые накапливают и высвобождают глицин, который действует аутокринным образом. Наконец, существует значительная положительная взаимосвязь между инсулином и GlyR, поскольку инсулин усиливает ток, активируемый глицином, зависимым от фосфоинозитид-3-киназы образом, петля положительной обратной связи, которую мы обнаружили, полностью теряется в β-клетках от доноров с T2D.

Введение

Многие нейротрансмиттеры модулируют секрецию инсулина, изменяя электрическую активность β-клеток через ионные каналы и рецепторы (1–4). Эти сигналы могут исходить от кровообращения, нервных волокон и / или островков поджелудочной железы (5). Правильная передача сигналов нейротрансмиттера имеет решающее значение для координации секреции инсулина всеми островками поджелудочной железы, и дисфункция этой передачи сигналов может быть связана с патогенезом диабета. Множество недавних метаболических исследований, посвященных изучению биомаркеров диабета 2 типа (T2D), выявили глицин в качестве потенциального кандидата (6–16).Существует сильная корреляция между концентрацией глицина в плазме и чувствительностью к инсулину (7,13), утилизацией глюкозы (8) и ожирением (9,17). Концентрация глицина в циркулирующей плазме обратно пропорциональна риску СД2 (6–8). Кроме того, добавка глицина повышает уровень инсулина в плазме (18,19).

Глицин — это заменимая аминокислота, которая в большом количестве содержится в продуктах, богатых коллагеном. В центральной нервной системе глицин действует как тормозящий нейротрансмиттер, активируя семейство лиганд-управляемых каналов Cl , называемых рецепторами глицина (GlyR).Они принадлежат к семейству пентамерных лиганд-управляемых ионных каналов и состоят из двух α- и трех β-субъединиц (20). Помимо глицина, GlyR также активируется β-аланином и таурином, тогда как стрихнин является мощным и специфическим ингибитором (20). Концентрации внеклеточного глицина регулируются транспортерами глицина (GlyT), которые принадлежат к Na + -зависимым транспортерам переносчиков растворенных веществ 6 (SLC6), где транспортер глицина 1 (GlyT1) переносит два Na + , один Cl . , и один глицин, и переносчик глицина 2 (GlyT2) совместно транспортирует три Na + , один Cl и один глицин (21).

Здесь мы исследовали роль глицина в секреции инсулина островками Лангерганса поджелудочной железы человека. Мы демонстрируем, что человеческие β-клетки экспрессируют GlyR, особенно GlyRα1, который опосредует деполяризующий ток Cl , который усиливает возбуждение потенциала действия, вход Ca 2+ и секрецию инсулина. Этот GlyR-опосредованный ток усиливается инсулином в β-клетках от доноров без T2D, но не в β-клетках от доноров с T2D, где мы обнаруживаем, что экспрессия белка GlyRα1 и токи, активируемые глицином, подавляются.Кроме того, человеческие β-клетки экспрессируют GlyT1 и GlyT2, которые опосредуют поглощение глицина, который высвобождается из β-клеток посредством Ca 2+ -зависимого экзоцитоза. Таким образом, аутокринная петля обратной связи глицин-инсулин положительно регулирует секрецию инсулина, и ее дисфункция может способствовать нарушению секреции при СД2 человека.

Дизайн и методы исследования

Культура клеток и трансфекция

Островки от 50 человек-доноров были выделены Институтом диабета Альберты IsletCore (22) или Лабораторией клинических островков (23) в Университете Альберты при наличии соответствующего этического разрешения Совет по этике исследований человека Университета Альберты (Pro00013094; Pro 00001754).Информация о донорах описана в дополнительных таблицах 1 и 2. Островки мышей были получены от мышей-самцов C57 / Bl6 в возрасте 10–12 недель, и эксперименты были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Альберты (AUP00000291). Островки собирали вручную и диспергировали путем инкубации в буфере без Ca 2+ (Life Technologies) с последующим растиранием. Суспензию клеток высевали на чашки Петри или покровные стекла и культивировали в среде RPMI (Corning или Life Technologies), содержащей 7,5 ммоль / л глюкозы, в течение> 24 ч перед экспериментами.Для измерения высвобождения глицина клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей субъединицу GlyRα1 мыши (предоставленную G.E. Yevenes и H.U. Zeilhofer, University of Zurich [24]), используя Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Плазмида, кодирующая GFP, была включена в качестве маркера трансфекции (pAdtrackCMV).

Электрофизиология

Пипетки-пластыри были извлечены из класса боросиликатов и отполированы огнем (сопротивление наконечника 4–7 Мегаом для большинства экспериментов и 3–4 Мегаом для экспериментов по инфузии Ca 2+ ).Регистрацию патч-зажим выполняли в стандартных конфигурациях целых клеток или в конфигурации с перфорированным патчем с использованием усилителя EPC10 и программного обеспечения Patchmaster (HEKA Electronik). Клетки непрерывно перифузировали внеклеточным раствором (за исключением экспериментов с остановленным потоком) при температуре бани ~ 32 ° C. После экспериментов типы клеток были установлены с помощью иммуноцитохимии, как описано ранее (25). Для регистрации мембранного потенциала и тока буфер Кребса-Рингера (KRB), состоящий из (в ммоль / л) 140 NaCl, 3.6 KCl, 0,5 MgSO 4 , 1,5 CaCl 2 , 10 HEPES, 0,5 NaH 2 PO 4 , 5 NaHCO 3 и 6 глюкоза (pH доведенная до 7,4 с помощью NaOH) использовалась в качестве раствора для ванны. . Для измерения высвобождения глицина внеклеточная среда содержала (в ммоль / л) 118 NaCl, 20 тетраэтиламмоний-Cl, 5,6 KCl, 2,6 CaCl 2 , 1,2 MgCl 2 , 5 HEPES и 6 глюкозы (pH доведен до 7,4). с NaOH). Для экспериментов с перфорированным пластырем раствор пипетки содержал (в ммоль / л) 76 K 2 SO 4 , 10 KCl, 10 NaCl, 1 MgCl 2 , 5 HEPES и 0.24 мг / мл амфотерицина B или 50 мкг / мл грамицидина (pH доведен до 7,35 с помощью КОН). Вызванные глицином мембранные токи регистрировали с помощью внутриклеточного раствора, содержащего (в ммоль / л) 130 KCl, 1 MgCl 2 , 1 CaCl 2 , 10 EGTA, 5 HEPES и 3 MgATP (pH доведен до 7,2 с помощью КОН). . Для измерения высвобождения глицина раствор пипетки состоял (в ммоль / л) из 120 CsCl, 1 MgCl 2 , 9 CaCl 2 , 10 EGTA, 10 HEPES, 3 MgATP и 0,1 цАМФ (pH доведен до 7,2 с помощью CsOH).Во время записи клетки зажимали при -70 мВ. Для экспериментов по высвобождению глицина анализ проводили с помощью программного обеспечения Mini Analysis 6 (Synaptosoft).

Иммуногистохимия

Депарафинированные срезы ткани поджелудочной железы человека нагревали в 10 ммоль / л цитрата Na + (pH 6) в течение 15 минут с последующей 15-минутной стадией охлаждения в том же буфере. Срезы промывали PBS и блокировали 20% козьей сывороткой в ​​течение 30 мин. Антитела против субъединицы GlyRα1 (разведены 1: 100 в 5% козьей сыворотке; Synaptic Systems), субъединицы GlyRα3 (разведены 1: 100 в 5% ослиной сыворотке; Santa Cruz Biotechnology), GlyT1 (разведены 1: 100 в 5% ослиной сыворотке; Santa Cruz Biotechnology) или GlyT2 (разведенный 1: 200 в 5% козьей сыворотке; антитела Atlas) затем добавляли к срезам и инкубировали в течение ночи.Срезы промывали PBS, а затем к срезам добавляли антитела к инсулину (разведенные 1: 1000 в козьей сыворотке [Sigma-Aldrich] и разведенные 1: 100 в 5% ослиной сыворотке [Santa Cruz Biotechnology]) и инкубировали их в течение 60 минут. После стадии промывки в PBS срезы инкубировали с флуоресцентно меченными вторичными антителами Alexa Fluor 594 и 488 (разведенные 1: 200; Thermo Fisher) в течение еще 60 мин. Образцы снова промывали, инкубировали с 300 нмоль / л DAPI (Thermo Fisher) в течение 5 мин и помещали в антифад ProLong (Life Technologies).Изображения были получены с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного системой визуализации Zeiss Colibri. Количественное отображение GlyR в островках от доноров с T2D и без него при постоянном времени воздействия анализировали с помощью Volocity (PerkinElmer). Вычитание фона выполняли с помощью программного обеспечения ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Измерения [Ca

2+ ] i

Диспергированные островковые клетки инкубировали в культуральной среде, содержащей 1 мкмоль / л Fura-2 AM (Life Technologies) в течение 10 мин.Покровные стекла помещали в инвертированный микроскоп и обрабатывали KRB, содержащим 6 ммоль / л глюкозы (если не указано иное). Флуоресценцию возбуждали при длине волны 340 и 380 нм (соотношение интенсивностей 5: 2) с использованием источника света олигохром (TILL Photonics) и объектива × 20 (Zeiss Fluar). Эмиссию контролировали на длине волны 510 нм, а изображения регистрировали при 0,5 Гц с использованием камеры устройства с усиленной зарядовой связью и программного обеспечения Life Acquisition (TILL Photonics). Типы клеток были идентифицированы после эксперимента с помощью иммуноцитохимии, как описано ранее (25).Коэффициенты возбуждения (340/380 нм) были впоследствии рассчитаны в автономном режиме на основе захваченных изображений в интересующих областях, соответствующих идентифицированным типам клеток, с использованием программного обеспечения ImageJ.

Секреция инсулина

Секрецию инсулина измеряли с помощью статических анализов секреции, как описано ранее (26), или путем перифузии при 37 ° C в KRB с (в ммоль / л) 115 NaCl, 5 KCl, 24 NaHCO 3 , 2,5 CaCl 2 , 1 MgCl 2 , 10 HEPES и 0,1% BSA (pH 7,4 с NaOH). Для перифузии перифузировали 15 островков на полосу (0.25 мл / мин) с 1 ммоль / л глюкозы KRB (с 1 мкмоль / л стрихнина или без него) в течение 24 минут, а затем в указанных условиях. Образцы собирали через 2-минутные интервалы. Островки лизировали в кислотно-этанольном буфере (1,5% концентрированной HCl, 23,5% уксусной кислоты и 75% этанола) для определения общего содержания инсулина. Образцы анализировали с использованием набора для обнаружения инсулина (Meso Scale Discovery).

Анализ данных

Данные выражены как средние значения ± SEM, если не указано иное. Статистическую значимость оценивали с помощью теста Стьюдента t или двухфакторного дисперсионного анализа. P Значения <0,05 считались значимыми.

Результаты

Экспрессия GlyR в островках человека от доноров с T2D и без него

Анализ

ОТ-ПЦР выявил экспрессию субъединиц GlyR α1, α3 и β в островках человека (дополнительный рисунок 1 A и B ) . Количественную иммунофлуоресценцию проводили на срезах ткани поджелудочной железы, взятых у доноров без T2D (4 донора) и от доноров с T2D (4 донора) для измерения уровней белка GlyRα1 и GlyRα3 в β-клетках.Иммуноокрашивание субъединиц GlyRα1 и GlyRα3 в срезах ткани поджелудочной железы выявило экспрессию в инсулин-положительных клетках от доноров с T2D и без них (рис. 1 и дополнительные рис. 2 и 3). Экспрессия GlyRα1 была выше у доноров без T2D (480 ± 35 средняя интенсивность пикселей [PI], 4 донора), чем у доноров с T2D (309 ± 24 средних PI, 4 донора; P <0,001) (рис. 1 B ). и дополнительный рис.1 C ), тогда как экспрессия GlyRα3 оказалась ниже, чем у GlyRα1, и не различалась между донорами без T2D (304 ± 24 в среднем PI, 4 донора) и с T2D (268 ± 30 в среднем PI, 4 донора) (Инжир.1 C и D и дополнительный рисунок 1 D ).

Рисунок 1

Экспрессия GlyR в островках человека. A : Типичные изображения экспрессии GlyRα1 в срезах ткани поджелудочной железы от доноров с T2D и без него по количественной иммунофлуоресценции (GlyRα1, красный; инсулин, зеленый; DAPI, синий). B : Среднее значение PI GlyRα1 в инсулин-положительных клетках от доноров с T2D и без. C : репрезентативные изображения экспрессии GlyRα3 в срезах ткани поджелудочной железы от доноров с T2D и без него по количественной иммунофлуоресценции (GlyRα3, красный; инсулин, зеленый; DAPI, синий). D : Среднее значение GlyRα3 PI в инсулин-положительных клетках от доноров с СД2 и без него. Диаграммы разброса представляют значения для отдельных островков от четырех доноров в каждой группе. *** P <0,001.

В соответствии с обнаружением субъединиц GlyR с помощью иммуноцитохимии, мы наблюдали значительные глицин-активированные токи Cl в человеческих β-клетках, которые были идентифицированы с помощью иммуноокрашивания инсулина после эксперимента (рис. 2 A и B ). ).Внеклеточное применение глицина (300 мкмоль / л) вызвало большие внутренние токи в 56 из 62 человеческих β-клеток (рис. 2 Ai ). Амплитуда тока в среднем составляла -316 пА (-26 ± 3 пА / пФ, 9 доноров) (рис.2 B ) и была наполовину активирована 90 мкмоль / л глицина ( n = 9 клеток, 2 донора). (Рис.2 C ). Вызванные глицином токи снижались на 92 ± 3% ( n = 7 клеток, 4 донора; P <0,001) в присутствии 1 мкмоль / л стрихнина. Вызванные глицином, чувствительные к стрихнину токи также были обнаружены в α-клетках, но токи выявлялись реже (3 из 10 клеток), а амплитуды были намного меньше по сравнению с β-клетками (−9.3 ± 2,1 пА и -3,2 ± 0,5 пА / пФ, 3 донора) (рис.2 Aii ). В β-клетках мыши глицин вызывал чувствительный к стрихнину ток только в 3 из 15 β-клеток (-26 ± 19 пА и -4,5 ± 2 пА / пФ) (рис. 2 Aiii ), тогда как глицин не вызывал ток в β-клетках крыс ( n = 11 клеток; данные не показаны), что указывает на видоспецифические различия в токах, вызванных глицином. Наконец, ток, активированный глицином, наблюдался в 36 из 52 β-клеток от доноров с T2D и имел среднюю амплитуду -151 пА.В соответствии со сниженным иммунным окрашиванием GlyRα1 островков от доноров с T2D, мы обнаружили в β-клетках от доноров с T2D, что вызванные глицином токи значительно меньше, чем у контрольных доноров без T2D (-12 ± 2 пА / пФ, н. = 36 клеток, 5 доноров; P <0,001) (рис.2 Aiv и B ). Чувствительный к глицину ток продемонстрировал обратный потенциал, соответствующий ожидаемому от тока, опосредованного Cl , в наших растворах (13.5 мВ, n = 18 клеток, 4 донора) (рис.2 D ).

Рисунок 2

Обнаружение GlyR-опосредованных токов Cl путем фиксации фрагментами целых клеток в островковых клетках человека. A : Репрезентативные кривые, показывающие глицин (300 мкмоль / л), вызванный внутренними токами (черные следы) в β-клетках от донора без T2D ( i ), в α-клетках ( ii ), в β-клетках мыши. -клетки ( iii ) и в человеческих β-клетках от донора с T2D ( iv ). Серые следы были получены в присутствии 1 мкмоль / л стрихнина.Обратите внимание на разные масштабные линейки. B : вызванные глицином внутренние токи, нормированные на размер клетки. C : кривая доза-ответ вызванных глицином токов в человеческих β-клетках. Ответы были нормализованы к ответам, полученным с глицином 300 мкмоль / л. D : Вольт-амперная зависимость токов, вызванных 300 мкмоль / л глицина. *** P <0,001 по сравнению с клетками от доноров без T2D.

Затем мы исследовали влияние глицина на мембранный потенциал β-клеток человека, используя конфигурацию перфорированного пластыря.В присутствии 6 ммоль / л глюкозы внеклеточное применение глицина (100 мкмоль / л) деполяризовало клетки и увеличило потенциал действия (рис. 3). В одной серии экспериментов (рис. 3 A – C ) глицин вызывал значительно более частое срабатывание потенциала действия (2,9 ± 0,5 Гц, n = 6 клеток, 2 донора) по сравнению с контрольными клетками (0,6 ± 0,2 Гц, n = 6 клеток, 2 донора; P <0,01) (рис.3 A и B ) и уменьшенная высота потенциала действия (46 ± 3 мВ, n = 6 клеток, 2 донора) по сравнению с контрольными клетками (56 ± 3 мВ, n = 6 клеток, 2 донора; P <0.05) (Рис.3 A и C ). В отдельной серии экспериментов этот эффект был предотвращен стрихнином (рис. 3 D ). Глицин деполяризовал β-клетки человека в среднем на 15 ± 3 мВ ( n = 7, 3 донора; P <0,01) (рис. 3 E ).

Рисунок 3

Влияние глицина на мембранный потенциал β-клеток человека. Регистрация мембранного потенциала выполняется с использованием конфигурации «перфорированный пластырь». A : Образец следа воздействия глицина (100 мкмоль / л) на β-клетки человека.Применение 100 мкмоль / л глицина вызывало значительное увеличение потенциала действия ( B ) и снижение высоты потенциала действия ( C ). D : Образец следа глицин-зависимой (100 мкмоль / л) деполяризации β-клеток до, во время и после нанесения 1 мкмоль / л стрихнина. E : Изменение мембранного потенциала в ответ на 100 мкмоль / л глицина. * P <0,05 и ** P <0,01.

Глицин

модулирует [Ca

2+ ] i в β-клетках

Затем мы исследовали эффекты глицина на [Ca 2+ ] i в островковых клетках человека.Идентичность всех клеток была подтверждена после экспериментов иммуноокрашиванием (фиг. 4 A ). Типичная запись от β-ячейки показана на рис. 4 B . Применение глицина увеличивало [Ca 2+ ] и в 50% (72 из 144) всех протестированных β-клеток (7 доноров). Ответы были аналогичными после добавления 100 мкмоль / л и 300 мкмоль / л глицина (55% и 42% отвечающих клеток соответственно) и исчезли в присутствии стрихнина (фиг.4 B и C ).Интересно, что в 7% (10 из 144) β-клеток содержание глицина уменьшалось, а не повышалось [Ca 2+ ] i , но в остальных 43% клеток явного эффекта не наблюдалось (рис. 4 ). D ). Мы сравнили исходный уровень [Ca 2+ ] i (до добавления глицина, при 6 ммоль / л внеклеточной глюкозы) в клетках, которые показали увеличение, отсутствие изменений и снижение [Ca 2+ ] i при нанесении глицина соответственно (рис. 4 E ). Клетки, которые ответили повышением [Ca 2+ ] i , имели значительно более низкий исходный уровень [Ca 2+ ] i , чем неответчики, тогда как значительно более высокий исходный уровень [Ca 2+ ] i был наблюдается в клетках, показывающих снижение после введения глицина.При 1 ммоль / л глюкозы доля клеток, отвечающих увеличением [Ca 2+ ] i (73% [11 из 15 клеток], 2 донора), была выше, чем при 6 ммоль / л глюкозы (43% [41 из 97 клеток]) и при 10 ммоль / л глюкозы (56% [18 из 32 клеток], 4 донора). Это сопровождалось более низким исходным уровнем [Ca 2+ ] i при 1 ммоль / л глюкозы (0,74 ± 0,02 условных единиц [AU]) по сравнению с 6 ммоль / л глюкозы (1,08 ± 0,04 AU) и 10 ммоль / л. глюкоза (0,86 ± 0,02 ЕД). Четкое увеличение [Ca 2+ ] и при добавлении глицина иногда также наблюдалось в α-клетках (рис.4 F ), но доля отвечающих клеток была намного ниже по сравнению с β-клетками (11% [14 из 124 клеток], 6 доноров), что согласуется с более низкой долей α-клеток, которые проявляли глицин-активированный Cl ток. Они также обычно требовали более высокой концентрации глицина, при этом 7% клеток отвечали на 100 мкмоль / л и 19% отвечали на 300 мкмоль / л. Наконец, внеклеточный Ca 2+ был необходим для того, чтобы вызвать ответ (Fig. 4 G ), а отсутствие Ca 2+ подавляло ответ на глицин на 99.8% ( n = 35 клеток, 5 доноров; P <0,01) (рис. 4 H ). Дополнительные кривые и увеличенные временные шкалы для этих экспериментов показаны на дополнительном рисунке 4.

Рисунок 4

Влияние глицина на [Ca 2+ ] i в островковых клетках. A : Ратиометрические изображения регистрировали в диспергированных островковых клетках с последующим определением типов клеток с помощью иммуноокрашивания. SST, соматостатин. B : Типичный след показывает влияние глицина (Gly) (100/100/300 мкмоль / л) на [Ca 2+ ] i в β-клетке в отсутствие или в присутствии стрихнина (Strych) ( 1 мкмоль / л). C : Площадь под кривой (AUC) во время 1-минутного нанесения 100 мкмоль / л глицина в отсутствие или в присутствии стрихнина (1 мкмоль / л) в тех же клетках ( n = 39 клеток из 9 экспериментов). Базовые значения (до нанесения глицина) вычитали. D : Следы трех β-клеток из одного и того же эксперимента, иллюстрирующие различные типы ответов [Ca 2+ ] i на глицин (100/300 мкмоль / л). Кривые показаны в масштабе (т. Е. Без корректировки базовых значений). E : исходные соотношения флуоресценции (до нанесения глицина) в β-клетках, которые отреагировали увеличением, отсутствием изменений или уменьшением [Ca 2+ ] i , соответственно ( n = 38, 40, и 10). Данные представлены в виде прямоугольных диаграмм (квадраты, средние; линии, медианы; прямоугольники, 25/75 процентили; усы, минимальные / максимальные значения). F : Влияние глицина (300 мкмоль / л) на [Ca 2+ ] i в α-клетке. G : характерный след показывает влияние глицина на [Ca 2+ ] i в отсутствие или в присутствии внеклеточного Ca 2+ и ответ Ca 2+ на 70 ммоль / л KCl. H : AUC во время 1-минутного нанесения 100 мкмоль / л глицина в отсутствие или в присутствии внеклеточного Ca 2+ . ** P <0,01 и *** P <0,001.

Взаимодействие между глицином и инсулином

Инсулин усиливает токи Cl в нейронах (27,28). Мы исследовали, играет ли инсулин роль в усилении передачи сигналов глицина в островках человека. В β-клетках, обработанных инсулином с концентрацией 10 мкмоль / л, вызванный глицином ток усиливался на 54 ± 17% ( n = 23, 8 доноров; P <0.01) по сравнению с контрольными клетками (рис. 5 Ai и B ). Мы подтвердили аналогичные результаты в ответ на лечение инсулином 100 нмоль / л (данные не показаны). Мы подозревали, что это было результатом передачи сигналов между рецептором инсулина и GlyR, поэтому мы предварительно инкубировали клетки со 100 нмоль / л вортманнином, ингибитором фосфоинозитид-3-киназы, для подавления передачи сигналов рецептора инсулина. Вортманнин предотвращал инсулинозависимое усиление вызванного глицином тока у доноров без СД2 (увеличение на 6 ± 4%, n = 12 клеток, 5 доноров; незначительно) (рис.5 Aii и B ). Интересно, что β-клетки от доноров с T2D не показали усиления вызванного глицином тока в ответ на инсулин (изменение на 5 ± 9% от исходного уровня, n = 13 клеток, 4 донора; незначительно) (рис. 5). Aiii и B ).

Рисунок 5

Взаимодействие глицина и инсулина. A : Типичный след инсулинозависимой амплификации тока глицина в человеческих β-клетках от донора без T2D ( i ), β-клетках, предварительно инкубированных с 100 нмоль / л вортманнина в течение 1 часа ( ii ), и β -клетки от доноров с T2D ( iii ).Контрольные токи глицина до лечения показаны черным цветом, а токи глицина после обработки инсулином 10 мкмоль / л в течение 1 мин показаны серым цветом. Аналогичные результаты были получены с инсулином 100 нмоль / л (данные не показаны). B : Площадь под кривой (AUC), нормализованная для управления токами глицина. При 6 ммоль / л глюкозы 300 мкмоль / л глицина умеренно увеличивает секрецию инсулина, тогда как 800 мкмоль / л глицин сильно увеличивает секрецию инсулина. C : Глицин индуцировал секрецию инсулина в интактных островках человека.Глицин дозозависимо увеличивал секрецию инсулина в зависимости от стрихнина. D : Динамическая перифузия секреции инсулина, стимулированная глюкозой, в контрольных и человеческих островках, обработанных стрихнином. P <0,001 по двустороннему дисперсионному анализу. E : AUC стимулированной глюкозой перифузии инсулина в отсутствие или в присутствии 1 мкмоль / л стрихнина. ** P <0,01 по сравнению с контролем 300 мкмоль / л глицина ( B ) или 0 глицина ( C ).

Как предполагалось в предыдущих исследованиях in vivo (18,19), мы подтвердили способность глицина индуцировать секрецию инсулина.При циркулирующих концентрациях 300 мкмоль / л глицин имел тенденцию увеличивать секрецию инсулина (изменение в 23 ± 8% по сравнению с контролем, n = 18 повторов, 6 доноров) (фиг. 5 C ) из интактных островков. Поскольку ожидается, что интерстициальная концентрация глицина превысит циркулирующий уровень, особенно потому, что β-клетки накапливают и высвобождают глицин (см. Ниже), мы также стимулировали интактные островки с помощью 800 мкмоль / л глицина. Эта концентрация, которая достигается при пероральном приеме глицина (18), дополнительно увеличивает секрецию инсулина (изменение в 34 ± 12%, n = 18 повторов, 6 доноров; P <0.01) (рис.5 С ) по сравнению с контролем. Антагонизм GlyR с 1 мкмоль / л стрихнина предотвращал глицин-зависимую секрецию инсулина в интактных островках при 300 и 800 мкмоль / л глицина (фиг. 5 C ). Мы дополнительно исследовали роль эндогенной передачи сигналов глицина в секреции инсулина, исследуя влияние стрихнина на динамические ответы секреции инсулина на высокий уровень глюкозы (рис. 5 D ). Стрихнин снижает стимулированную глюкозой секрецию инсулина островками человека ( n = 10 повторов, 5 доноров; P <0.001 двусторонним дисперсионным анализом; площадь под кривой P = 0,054) (рис.5 E ).

Высвобождение глицина из β-клеток человека

Островки поджелудочной железы крысы содержат ~ 6 ммоль / л глицина (29). Иммуногистохимия и электронная микроскопия иммунного золота показывают, что β-клетки крысы экспрессируют везикулярный переносчик аминокислот (VIAAT / VGAT), который опосредует захват глицина синаптическими пузырьками в нейронах и накапливает глицин в секреторных гранулах (30). Эти данные и способность стрихнина ингибировать секрецию инсулина островками человека (см. Выше) предполагают, что β-клетки могут высвобождать глицин путем экзоцитоза, опосредуя аутокринную передачу сигналов.С помощью флуоресцентной иммуногистохимии мы обнаружили, что островковые клетки человека экспрессируют оба из GlyT, GlyT1 и GlyT2, которые, по-видимому, локализуются как в β-, так и в не-β-клетках (рис. 6 A и B и дополнительный рис. 5). . Мы исследовали высвобождение глицина из β-клеток, адаптировав анализ на основе патч-кламп, который ранее использовался для обнаружения экзоцитотического высвобождения γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) и АТФ (3,31,32). Изолированные островковые клетки человека трансфицировали плазмидным вектором, сверхэкспрессирующим GlyRα1, что приводило к примерно семикратному увеличению вызванных глицином токов.Эти GlyR будут ощущать высвобождение глицина из одних и тех же клеток, вызывая токи, которые легко обнаружить. Трансфицированные клетки стимулировали инфузией 2 мкмоль / л свободного Ca 2+ . Типичный эксперимент показан на рис. 6 Ci . На фоновый ток накладываются спонтанные переходные внутренние токи (TIC). Они активировались быстро (6,4 ± 2,5 мс, время нарастания 10–90%, n = 7, 2 донора) и распадались более постепенно, с полушириной 10,5 ± 3,5 мс, напоминающей тормозные постсинаптические токи в нейронах.TICs полностью подавлялись стрихнином (Fig. 6 Cii ), предполагая, что каждый TIC отражает экзоцитоз глицинсодержащей везикулы.

Фиг.6.

Секреция глицина β-клетками человека и активность GlyT. Срезы ткани поджелудочной железы человека иммуноокрашивали на GlyT1 ( A ) (красный), GlyT2 ( B ) (красный) и инсулин (зеленый). Ядра окрашивали DAPI (синий). C : β-Клетки, сверхэкспрессирующие субъединицы GlyRα1, зажимали при -70 мВ и вводили внутриклеточный раствор, содержащий ~ 2 мкмоль / л свободного Ca 2+ .Воспламенение TIC ( i ) подавлялось в присутствии 1 мкмоль / л стрихнина ( ii ). D : Суммарный след TIC глицина от контрольных клеток и после замены Na + на Li + для блокирования активности GlyT. E : Общее время затухания от TIC. F : Образец следа экспериментов с остановленным потоком для оценки клиренса глицина из контрольных клеток и после замены Na + на Li + для блокирования активности GlyT. G : Общее время затухания из экспериментов с остановленным потоком.* P <0,05 по сравнению с контролем.

Концентрация глицина в спинномозговой жидкости составляет ∼5 мкмоль / л (33), тогда как уровни глицина в плазме примерно в 40 раз выше (150–400 мкмоль / л) (8,18). Эти уровни глицина в плазме выше полумаксимальной эффективной концентрации (EC 50 ) GlyR в β-клетках (см. Выше), и лиганд-зависимые ионные каналы снижают чувствительность во время длительного воздействия высоких концентраций агонистов. Для определения того, очищают ли β-клетки от глицина за счет активности GlyT, чтобы поддерживать низкую внутриостровную концентрацию глицина, использовали два метода.Во-первых, мы исследовали клиренс после высвобождения эндогенного глицина. Поскольку GlyT требует Na + для совместной транспортировки глицина, внеклеточный Na + был заменен на Li + для эффективного ингибирования как GlyT1, так и GlyT2 (34). β-Клетки, сверхэкспрессирующие GlyRα1, стимулировали к секреции глицина в присутствии и в отсутствие Na + , и был охарактеризован клиренс глицина. На рисунке 6 D показано усредненное событие TIC с заменой Na + на Li + и без нее ( n = 7 клеток, 21 событие, 2 донора для контроля; n = 5 клеток, 58 событий. , 2 донора на Li + замена ).Замена Li + значительно увеличила общее время распада глицинового TIC с 18 ± 6 до 42 ± 6 мс ( P <0,05) (рис. 6, E ).

Во-вторых, мы исследовали клиренс экзогенного глицина в эксперименте с остановленным потоком (34). После быстрого местного применения глицина 100 мкмоль / л вместо применения внеклеточного раствора для смывания локально высокой концентрации глицина и предотвращения десенсибилизации рецепторов системы перфузии были остановлены. В этом сценарии внеклеточный глицин в первую очередь удаляется за счет диффузии и активности GlyT.На рис. 6 F показан образец графика эксперимента с остановленным потоком. После замены Li + клеткам требовалось больше времени (74 ± 9 с) для возврата к исходному уровню по сравнению с их контролем (43 ± 4 с, n = 10 клеток, 3 донора; P <0,05) (рис. 6 G ).

Обсуждение

В текущем исследовании мы обнаружили, что GlyR и GlyT высоко экспрессируются в β-клетках человека и что активация GlyR стимулирует электрическую активность, увеличивает [Ca 2+ ] i и усиливает секрецию инсулина.Недавно сообщалось, что GlyR в островках человека экспрессируется специфически в α-клетках, но не в β-клетках (35), что подтверждается открытием, что глицин стимулировал секрецию глюкагона, но не секрецию инсулина островками человека. Однако эксперименты проводились в отсутствие глюкозы, что приводит к активации нефизиологически больших токов K ATP в β-клетках и может предотвратить любое влияние глицина на мембранный потенциал. Ли и др. (35) наблюдали ответы [Ca 2+ ] и при применении глицина в подмножестве диспергированных островковых клеток, но однозначная идентификация типов клеток не проводилась.Наши данные ясно демонстрируют, что среди островковых клеток человека GlyR и токи Cl , активируемые глицином, наиболее активны в β-клетках.

Эффект глицина на [Ca 2+ ] i в β-клетках блокировался антагонистом GlyR стрихнином, демонстрируя, что он не был вторичным по отношению к Na + -зависимому захвату аминокислоты, как сообщалось ранее. для β-клеток мыши (36). Текущая активность GlyR была значительно ниже в β-клетках мыши по сравнению с β-клетками человека и не определялась в β-клетках крыс.Это наблюдение дополняет ранее описанные различия между островками человека и грызунов (25,37,38). Можно предположить, что это отражает различия в диетах: содержание глицина в мясе (6,5% аминокислот [39]) более чем вдвое превышает содержание белка пшеницы (2,8% аминокислот [40]).

В отличие от GlyR в центральной нервной системе, которые являются ингибирующими, мы демонстрируем, что активация GlyR поджелудочной железы увеличивала [Ca 2+ ] i в большинстве β-клеток, но имела ингибирующий эффект в небольшой популяции клеток.Как можно объяснить эти расходящиеся эффекты? Активация проницаемого для Cl GlyR будет приводить мембранный потенциал к равновесному потенциалу Cl (E Cl ). Ранее мы сообщали, что E Cl в β-клетках составляет ~ -40 мВ, что выше порога для электрической активности (1). Наши данные предполагают, что некоторые β-клетки деполяризовались за пределами E Cl перед добавлением глицина и что глицин, следовательно, гиперполяризовал, а не деполяризовал эти клетки и, таким образом, уменьшал [Ca 2+ ] i .В подтверждение этого, клетки, отвечающие снижением [Ca 2+ ] i , показали значительно более высокий исходный уровень [Ca 2+ ] i , чем клетки, которые ответили увеличением. Положительный E Cl по сравнению с нейронами (<–60 мВ) отражает более высокую внутриклеточную концентрацию Cl в β-клетках (41).

Концентрация глицина в плазме примерно в 40 раз выше, чем в спинномозговой жидкости, и выше EC 50 для активации GlyR.Действительно, мы полагаем, что локальная внеклеточная концентрация глицина в островках значительно ниже из-за GlyT-зависимого клиренса глицина. Эти переносчики очень эффективны при очистке от глицина (V max = 379 пмоль / мин / мг для GlyT1 и 5730 пмоль / мин / мг для GlyT2 [42]), и активность GlyT стимулируется по мере того, как клетка становится более гиперполяризованной (т. Е. в периоды покоя или между характерными медленными волнами деполяризации β-клеток [34]). Наши эксперименты показывают, что ингибирование GlyT посредством замены Li + приводит к почти удвоению эндогенного сигнала глицина, предполагая, что GlyT не только очищает глицин плазмы, но также регулирует передачу сигналов глицина в клетках.Аналогичным образом, экзогенное применение глицина в экспериментах с остановленным потоком продемонстрировало значительную потерю клиренса глицина во время ингибирования GlyT, и это, вероятно, преувеличено в ограниченном межклеточном пространстве, в отличие от изолированных клеток, изученных здесь.

Мы исследовали, секретируется ли глицин из β-клеток, выполнив эксперименты с патч-зажимом в клетках, сверхэкспрессирующих GlyR, которые служат сенсорами для глицина, высвобождаемого из той же клетки (т.е. аутосинапс). Хотя эксперименты в принципе должны быть осуществимы на нетрансфицированных клетках, сверхэкспрессия GlyR значительно повышает чувствительность анализа.Мы обнаружили, что инфузия Ca 2+ вызывает TIC, которые отражают экзоцитотическое высвобождение GlyR-активирующего соединения. Вероятно, что это соединение в основном представляет собой глицин, секретируемый гранулами инсулина, синаптическими микровезикулами или и тем, и другим (30), но мы не можем исключить таурин, который также присутствует в высоких концентрациях в островках (29). Подобно рецепторам GABA и GABA A (1) и рецепторам ATP и P2 (2,3), аутокринная активация GlyR может составлять положительную аутокринную петлю обратной связи в β-клетках человека.

Проглатывание глицина снижает уровень глюкозы в крови (18), и было высказано предположение, что глицин стимулирует секрецию инсулина у людей. Хотя физиологический глицин (300 мкмоль / л) имел тенденцию только увеличивать секрецию инсулина, глицин в концентрации 800 мкмоль / л значительно увеличивал секрецию инсулина. Мы полагаем, что в исследованиях секреции инсулина, где островки были интактными, клетки в ядре островков не испытывали таких же концентраций глицина, как клетки на внешней стороне, что объясняет несоответствие в концентрациях глицина, вызывающих реакцию.Помимо демонстрации способности глицина стимулировать инсулин, мы продемонстрировали, что инсулин также отвечает за усиление тока глицина и что для этого требуется активация фосфоинозитид-3-киназы, которая находится ниже по течению от рецептора инсулина. Хотя мы не пытались использовать антагонисты рецепторов инсулина, наши результаты согласуются с зависимым от рецептора инсулином усилением тока глицина в спинномозговых нейронах мышей (27).

Наконец, мы продемонстрировали, что β-клетки от доноров с T2D имеют значительно более низкую экспрессию GlyR, более низкий ток глицин-активированного Cl , чем β-клетки от доноров без T2D, и невосприимчивы к эффектам инсулина, что, возможно, подразумевает Инсулинорезистентность β-клеток как вклад в снижение экспрессии GlyR при СД2.Точный механизм подавления GlyRα1 в этих клетках неясен, но может быть связан с нарушением транспорта или активности перед лицом инсулинорезистентности β-клеток или снижением уровня белка ниже экспрессии мРНК, которая увеличивалась при T2D (дополнительный рисунок 1 ). В ).

Таким образом, мы демонстрируем здесь, что каналы GlyR Cl высоко экспрессируются в β-клетках человека и способствуют регуляции электрической активности и передаче сигналов [Ca 2+ ] i через аутокринную петлю обратной связи с инсулином. .Наши результаты обеспечивают физиологическую основу для ранее наблюдаемого положительного влияния аминокислоты на толерантность к глюкозе у человека и потенциального механизма, способствующего нарушению секреции инсулина при СД2.

Информация о статье

Благодарности. Авторы благодарят старшего автора этой работы, покойного доктора Матиаса Брауна, за руководство и видение в этом исследовании, и их соавтора, покойного Стивена Чели, за его усилия и вклад во время его пребывания с их группой в Эдмонтоне.Авторы благодарят докторов наук. Куан Чжан и Патрик Рорсман (Оксфорд) за полезные комментарии, способствовавшие завершению этой рукописи, а также Алию Спигельман (Эдмонтон) и Нэнси Смит (Эдмонтон) за помощь в анализе человеческого инсулина. Островки человека были предоставлены Лабораторией выделения клинических островков Университета Альберты (доктора Джеймс Шапиро и Тацуя Кин) и Институтом диабета Альберты IsletCore. Авторы благодарят программы по закупке и обмену человеческих органов (HOPE) и Trillium Gift of Life Network (TGLN) за усилия по получению поджелудочной железы человека для исследований.

Финансирование. R.Y.-D. была поддержана стипендиями от Диабетического фонда Альберты. Завершение этой работы было частично профинансировано за счет операционного гранта компании P.E.M. от Канадского института исследований в области здравоохранения (MOP 310536). P.E.M. заведует кафедрой канадских исследований в области биологии островков.

Двойственность интересов. О потенциальных конфликтах интересов, относящихся к этой статье, не сообщалось.

Вклад авторов. R.Y.-D., E.D., J.E.M.F., X.D., K.S., S.K., A.B., M.F., J.L., X.W., S.C. и M.B. исследовали данные и проанализировали результаты.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

2008 - 2021 | Охотники за сердцами