Дст тест на туберкулез: Диаскинтест: что это такое (Сергиев Посад)

Содержание

🧬 Что нужно знать про тесты на туберкулез

Всероссийское общество фтизиатров утвердило несколько возможных вариантов тестирования, включая не только пробу Манту, но и тестирование с использованием Диаскин-теста и Т-теста. Результаты каждого из этих тестов будут признаваться достаточными для приема ребенка в детский сад, — сообщается на официальном сайте Минздрава.

Медицинский директор, педиатр GMS Clinic Олег Тогоев дал свой комментарий информационному порталу «Здоровые дети».

Манту — не единственный официальный скрининг. Родители могут самостоятельно принимать решения о способе тестирования ребенка.

Что это за тесты и чем они отличаются?

Реакция Манту (туберкулиновая проба) является на сегодняшний день в России основным методом профилактического обследования детей на инфицирование туберкулезом.

  • Реакция Манту — это ответ организма на введение туберкулина (несмотря на название, саму туберкулезную палочку препарат не содержит). После введения в кожу препарата возникает небольшое специфическое воспаление — «пуговка». Измеряя линейкой ее диаметр, можно оценить напряженность иммунитета к туберкулезной палочке. Измерение проводят через 72 часа после введения препарата.
  • Тест делается один раз в год, начиная с года и до 16 лет.
  • Мочить место пробы можно.

Диаскин-тест — это способ диагностики туберкулеза путем введения препарата под кожу ребенка. Он позволяет определить наличие или отсутствие микобактерий туберкулеза в организме ребенка. Диаскин-тест является более чувствительным тестом, поскольку в его состав входят белки, вызывающие иммунную реакцию в организме только на микобактерии, вызывающие туберкулез.

  • Тест по сравнению с реакцией Манту позволяет определить не только наличие возбудителя, но и активность микобактерий, вызывающих само заболевание.
  • Сегодня этот тест делается в случаях, если проба Манту — положительная.
  • Мочить место введения препарата можно.

Т-спот — тест на туберкулез, который проводится путём забора крови ребёнка и ее последующего исследования.

  • «T» обозначает T-лимфоциты (клетки крови, на основе ответа которых производится исследование).
  • «SPOT» (от англ. — «пятно»). В результате лабораторного опыта образуются пятна, каждое из которых маркирует Т-лимфоцит. Этот способ определения носительства туберкулеза позволяет исключить ложноположительные реакции на носительство микобактерии туберкулеза.

Олег Тогоев, педиатр, медицинский директор GMS Clinic прокомментировал: «Скажу в первую очередь, что дети обязательно должны проходить один из утвержденных скринингов на туберкулез, потому что это заболевание, к несчастью, существует, и оно контагиозно (то есть, заразно — прим. ред.). Моя рекомендация — диаскин-тест, как наиболее оптимальный скрининг на туберкулез. Его основное преимущество в том, что он редко (в 10 случаев из 100) бывает ложноположительным. То есть, если уж диаскин-тест положителен, то на это можно смело опираться, искать и подтверждать туберкулезную инфекцию другими методами — есть большая вероятность что-то найти. Что касается пробы Манту, то количество ложноположительных реакций (то есть, специфичность теста) составляет 35 случаев на 100 проб. Таким образом, 35 человек из 100 с положительной пробой Манту отправятся к фтизиатру зазря. Единственный минус — это сегодняшняя дороговизна диаскина, он стоит в несколько раз дороже туберкулина для пробы Манту. Видимо, из-за этого он не может применяться массово. Т-тест — ещё „сырой“ вариант. Я, например, почти ничего и не слышал о нем. Его специфичность, чувствительность мне неизвестны. Он может быть хорош для контроля лечения туберкулезной инфекции, для диагностики видов туберкулезных бактерий, для различных узких задач, но он может быть плох для скрининга. Так же, как ПЦР: за ее открытие получена Нобелевская премия, благодаря этому методу были и еще будут сделаны невероятные открытия, это современно, это отлично, но этот метод вообще не годится для массового скрининга на туберкулез — вот такой парадокс.

Поэтому старая добрая проба Манту, которой уже почти 100 лет, до сих пор своей актуальности не потеряла, просто нужно правильно и грамотно интерпретировать ее результаты».

Источник: healthy-kids.ru

Диагностика туберкулеза у детей

Туберкулез является широко распространенным инфекционным заболеванием, имеющим высокую социальную значимость. Часто заболевание не имеет выраженных проявлений. Поэтому так важна полноценная и своевременная диагностика туберкулеза, особенно у детей.

Какие методы диагностики туберкулеза существуют сегодня?

Проба Манту

Уже более века туберкулиновая проба Манту является привычным методом выявления туберкулезной инфекции. Она используется в основном при массовой диагностике среди детей и подростков. Целью проведения туберкулиновой пробы (пробы Манту) является как раннее выявление туберкулеза, так определение необходимости повторной вакцинации здоровых детей для развития специфического иммунитета.

Суть метода заключается в том, что внутрикожно вводится специальное вещество – туберкулин – компонент микробактерий туберкулеза. Спустя три дня медицинский работник оценивает реакцию организма на него. Проба Манту – это не прививка. Этот особый тест показывает наличие иммунитета к микобактериям туберкулеза, никакого риска заражения туберкулезом от проведенной пробы нет.


Несмотря на широкую распространенность этого метода, его дешевизну и простоту, возможность большого охвата населения, имеется ряд недостатков:

  • Необходим особый уход за местом инъекции;

  • Высокая частота ложноположительных или ложноотрицательных результатов, в том числе провоцируемых различными внешними и внутренними факторами.

Если ребенок был привит менее чем за месяц до пробы, переболел или было обострение какого-либо хронического заболевания, или ребенок чесал место пробы, его заклеивали пластырем, применяли антисептики – результаты могут быть искажены. Также результаты искажаются при нарушении техники проведения или качества препарата (хранили или перевозили неправильно). Реакция может возникать и при наличии в организме микроорганизмов, сходных с туберкулезными микобактериями, или при наличии аллергии, в том числе и на само вещество. Таким образом, проба Манту дает только общие представления о том, есть ли иммунитет к туберкулезу или нет.

Диаскинтест

Более 10 лет назад был расшифрован геном микобактерий туберкулеза. Открытие антигенов, специфичных для M. Tuberculosis человека, позволило разработать препарат Диаскинтест® (ДСT), который представляет собой комплекс рекомбинантных белков продуцируемых специальной кишечной палочкой. Он так же, как и Манту, предназначен для внутрикожного введения. Все дети с положительной реакцией на пробу Манту, выявленные при массовых обследованиях, при наличии соответствующих показаний направляются на консультацию к детскому фтизиатру в противотуберкулезную организацию для диагностики активного туберкулеза и виража пробы Манту, где им в обязательном порядке делают внутрикожную пробу с ДСТ. При положительной реакции на ДСТ всех детей тщательно обследуют, в том числе с применением компьютерной томографии.

Диаскинтест:

  • позволяет уточнять и отсеивать ложноположительные реакции на пробу Манту,

  • позволяет исключить некоторые ошибки диагностики туберкулеза,

  • применяется в тех случаях, когда родители отказываются от пробы Манту, потому как представляет собой еще более «чистый» препарат, содержащий только белок, по своему строению идентичный белкам микобактерий туберкулеза.

Однако, он имеет ряд недостатков, так как также может давать ложноотрицательные результаты, не выявляет ранние и латентные формы туберкулеза, стоит дороже и также зависит от многих внешних и внутренних факторов, в том числе от техники введения, состояния здоровья ребенка.

Таким образом, проведение ДСТ отсеивает детей с аллергией на туберкулин, детей с ложными положительными реакциями и выявляет именно тех детей, которые подозрительны по инфицированию туберкулезом или которые уже болеют им.

Квантифероновый тест

Один из современных методов лабораторной диагностики туберкулеза, который помогает в выявлении как активного, так и скрытого туберкулеза. При его проведении никаких внутрикожных проб не ставят, а просто забирают венозную кровь на анализ, как при любом другом лабораторном исследовании. Этот метод выявляет в крови ребенка специфический интерферон, который может обнаружиться только у инфицированных туберкулезом.

Преимуществами теста являются его высокая чувствительность и специфичность, отсутствие каких-либо противопоказаний к проведению, он может проводиться вне зависимости от вакцинаций и болезней ребенка. Результаты анализа не зависят от вакцинации БЦЖ.

Квантифероновый тест делают в тех случаях, когда требуется выявление туберкулёзной инфекции после получения сомнительных результатов пробы Манту или ДСТ. Метод может использоваться для выявления туберкулёза в детских учреждениях во время карантина (когда использование внутрикожных проб недопустимо). Также тест применяют для выявления инфекции у лиц из групп риска — медицинских работников отделений ВИЧ-инфицированных, противотуберкулезных организаций, тюремных больниц, людям с противопоказаниями для туберкулиновой пробы.

Существенным недостатком теста является то, что он не может отличить обычное инфицирование и болезнь. Большинство взрослых людей в течении жизни, так или иначе, встречаются с возбудителем туберкулеза, хотя болезнь не развивается. Кроме того квантифероновый тест в 10% случаев дает ложноотрицательные результаты (при инфицировании особым штаммом «коровьего» туберкулеза). Тест довольно дорогой, делают его далеко не во всех лабораториях.

Наряду с кванифероновым тестом применяются и такие высокоточные лабораторные исследования, как ПЦР диагностика или анализ Т-клеточного маркера туберкулеза. В целом, они обладают теми же достоинствами и недостатками, что и квантифероновый тест и их используют для уточнения диагноза.

Теперь мы видим, что нет идеального единого метода диагностики. Диагностику туберкулеза проводят комплексно и поэтапно. Это позволяет выявить детей, которым необходима консультация фтизиатра, профилактическое лечение или полноценная противотуберкулезная помощь.

Часто задаваемые вопросы | Противотуберкулезный диспансер

Что нужно знать про тесты на туберкулез?

Всероссийское общество фтизиатров утвердило несколько возможных вариантов тестирования, включая не только пробу манту с 2ТЕ, но и тестирование с использованием Диаскинтеста и T-spot. Результаты каждого из этих тестов будут признаваться достаточными для приема ребенка в детский сад.

Что это за тесты и чем они отличаются?

1.    Реакция манту с 2ТЕ/(туберкулиновая проба).
Реакция манту является на сегодняшний день в России основным методом профилактического обследования детей (с 1 года до 8 лет) на инфицирование (заражение) туберкулезом. Реакция манту с 2ТЕ – это ответ организма на введение туберкулина (не смотря на название, саму туберкулезную палочку препарат не содержит). Оценивается напряженность иммунитета ребенка к туберкулезной палочке. До настоящего времени туберкулиновая проба не теряет своей актуальности, просто надо правильно и грамотно интерпретировать ее результаты.


2.    Диаскинтест (ДСТ) – способ, который позволяет определить наличие или отсутствие микобактерий туберкулеза в организме ребенка. ДСТ является более чувствительным тестом, поскольку в его состав входят белки, вызывающие иммунную реакцию в организме только на микобактерии, вызывающие туберкулез. ДСТ по сравнению с реакцией манту 2ТЕ позволяет определить не только наличие возбудителя, но и активность микобактерии, вызывающих само заболевание.


3.     Т-spot – тест на туберкулез, который проводится путем забора крови ребенка и ее последующее исследование (коммерческий метод).
Дети должны обязательно проходить один из утвержденных скринингов на туберкулез, потому что в настоящее время отмечается рост заболевания туберкулезом в нашем городе и эти тесты предназначены для раннего выявления туберкулеза у детей.

Наиболее оптимальный вариант – ДСТ. Его основное преимущество в том, что он крайне редко бывает ложноположительным. То есть, если ДСТ положительный, то можно смело говорить об активности туберкулезной инфекции у ребенка. Устанавливается факт инфицирования (заражения) микобактериями туберкулеза, что требует дальнейших диагностических мероприятий (включая компьютерную томографию органов грудной клетки) для исключения локального туберкулеза.

 

ЗНАЧЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ТЕСТОВ В ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА У ДЕТЕЙ | Яблонский

1. Гегеева Ф.Э. Клинико-рентгенологическая диагностика «малых» форм туберкулеза внутригрудных лимфатических узлов у детей: Автореф. дис. … канд. мед. наук. – М., 2006. – 20 с.

2. Даулетова Я.А.. Оптимизация диагностики туберкулеза внутригрудных лимфатических узлов у детей: Автореф. дис. … канд. мед. наук. – Новосибирск, 2009. – 22 с.

3. Довгалюк И.Ф., Корнева Н.В. Клинико-эпидемические особенности туберкулеза у детей Северо-Запада Российской Федерации // Туберкулез и болезни легких. – 2011. – №3. – С. 12-16.

4. Клинико-лабораторные (иммунобиохимические) методы в диагностике, определении активности и выборе тактики лечения различных проявлений туберкулезной инфекции от инфицирования до локальной формы с осложненным течением: Пособие для врачей / Сост. И.Ф. Довгалюк, Ю.Э. Овчинникова, М.Н. Кондакова, М.Е. Дьякова, Е.И. Потапенко. – СПб., 1999. – 21 с.

5. Кожная проба с препаратом Диаскин-тест® (аллерген туберкулезный рекомбинантный 0,2 мкг в 0,1 мл раствор для внутрикожного введения) для идентификации туберкулезной инфекции: Пособие для врачей / Сост. Б.Л. Медников, Л.В. Слогоцкая. – М., 2009. – 32 с.

6. Корнева Н.В. Возможности оптимизации диагностики туберкулеза органов дыхания у детей (на примере Северо-Западного региона Российской Федерации): Автореф. дис. … канд. мед. наук. – СПб., 2011. – 23 с.

7. Лазарева Я.В. Значение компьютерной томографии в диагностике и классификации туберкулеза // Пробл. туберкулёза и болезней лёгких. – 2005. – № 12 . – С. 14-19.

8. Овсянкина Е.С., Слогоцкая Л.В., Губкина М.Ф. Рекомендации по применению кожной пробы с препаратом аллерген туберкулезный рекомбинантный 0,2 мкг в 0,1 мл раствор для внутрикожного введения (ДИАСКИНТЕСТ®) для идентификации туберкулезной инфекции у детей и диспансерного наблюдения в противотуберкулезных учреждениях: Методические рекомендации. – М.: МНПЦБТ, 2010. – 29 с.

9. Определение состояния иммунитета и уровня цитокинов для оценки течения туберкулеза легких: Пособие для врачей / Сост. Б.Э. Кноринг, Н.М. Чужова, И.Я.Сахарова, Е.М. Леонченко, Т.Б. Ряснянская. – СПб., 1998. – 21 с.

10. Слогоцкая Л.В., Кочетков Я.А., Филинов А.В. Диаскинтест-новый метод выявления туберкулеза // Туберкулез и болезни легких. — 2011. – № 6. – С. 17-22.

11. Шилова М.В. Организация противотуберкулезной помощи в России и пути модернизации организационно-методического управления диспансерным наблюдением больных туберкулезом в современных эпидемических и социально-экономических условиях // Туберкулез и болезни легких. – 2011. – № 5. – С. 236.

12. Adams L.V., Waddell R.D, Reyn C.F T-SPOT.TB Test(R) results in adults with Mycobacterium avium complex pulmonary disease // J. Infect. Dis. – 2008. – Vol. 40. – P. 196-203.

13. Detjen A.K. Interferon-gamma release assays improve the diagnosis of tuberculosis and nontuberculous mycobacterial disease in children in a country with a low incidence of tuberculosis // Clin. Infect. Dis. – 2007. – Vol. 45. – P. 322-328.

14. Streeton J.A., Desem N., Jones S.L. Sensitivity and specificity of a gamma interferon blood test for tuberculosis infection // Int. J. Tuberc. Lung Dis. – 1998. – Vol. 2. – P. 443-450.

Диагностика туберкулеза методом T-SPOT.TB

Диагностика туберкулеза методом T-SPOT.TB

ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА МЕТОДОМ T-SPOT.TB

 В ГБУЗ ПК «Клинический фтизиопульмонологический медицинский центр»

1) г. Пермь:

  • Детская поликлиника ГБУЗ ПК «КФМЦ»:

Адрес: г. Пермь, ул. Металлистов, 9.

Проезд от ст. Пермь II трамваем маршрута №4; от ост. «Центральный рынок»: автобусами маршрутов №77, 36, 32, трамваем №11 до остановки «Рабочий поселок».

Часы работы поликлинического отделения:

пн.- пт.: 8.00 — 19.00

сб.: 9.00 — 15.00

вс.:  выходной день.

Телефон регистратуры: (342) 206-34-01

E-mail:

  • Взрослая поликлиника:

Адрес: 614045, Пермь, ул. Советская 102б.

Забор крови производится каждую среду с 10-00 до 10-30

Телефон регистратуры: (342) 233-21-82

E-mail: 

  • Для проведения T-SPOT.TB необходимо записаться в детской или взрослой поликлинике (стоимость можно узнать в прейскуранте) и уточнить дату сдачи крови.

2) г. Чайковский:

Обследование на тест T-spot проводится в лаборатории Чайковского филиала ГБУЗ ПК «КФМЦ» (г. Чайковский, ул. Речная, д. 2 Б).

Запись на обследование по телефонам: 7-40-20; 7-40-22

График приема анализов:

  • Понедельник: с 8-00 до 15-00
  • Среда: с 8-00 до 15-00
  • Четверг: с 8-00 до 9-30

3) г. Березники:

8(34242) 6-39-82, 8(34242) 6-79-98

Обследования проводятся при наличии информированного согласия законных представителей несовершеннолетних детей.

T-SPOT.TB— это иммунологический способ диагностики туберкулеза.

Внимание! Для его проведения нужна кровь исследуемого.

Название T-SPOT.TB расшифровывается так:

литера T обозначает T-лимфоциты, клетки крови, на основе ответа которых производится исследование

Слово SPOT это перевод с английского языка, означающий «пятно». В результате лабораторного опыта в лунке образуются пятна, каждое из которых маркирует Т-лимфоцит.

TB это сокращенное международное обозначение туберкулеза.

Важно помнить, что Т-СПОТ является способом количественной диагностики наличия в организме туберкулеза, но не дает возможности отличить активную форму туберкулеза  от  латентной.

К альтернативным методам обследования на туберкулезную инфекцию относятся диагностические тесты in vitro, основанные на высвобождении Т-лимфоцитами ИФН-g (гамма- интерферон).

В настоящее время в условиях ГБУЗ ПК «КФМЦ»  проводится коммерческий диагностический тест, T-SPOT.TB (в России методика использования Т-СПОТ зарегистрирована в 2012 году (регистр. УД № ФСЗ  2012/648), с помощью техники Elispot, определяющий количество мононуклеарных клеток периферической крови, продуцирующих ИФН-γ [2].

Диагностический тест T-SPOT. TB является непрямым методом исследования инфекции, вызванной M.tuberculesis (включая заболевание), его использование рекомендуется в качестве дополнения к стандартным диагностическим исследованиям.

Внимание!  Проба Манту с 2ТЕ ППДЛ и проба с Диаскинтестом, рентгенологические обследования проводятся на бесплатной основе.

Иммунологический тест in vitro (T-Spot) проводится как альтернативный метод, он не входит в программу государственных гарантий по организации бесплатной медицинской помощи гражданам и проводятся на платной основе. Стоимость исследования можно узнать в прейскуранте.

 СЛУЧАИ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Т-СПОТ

·  у лиц с аллергическими и аутоимунными заболеваниями;

·  у детей, привитых БЦЖ, у которых выявлено ложноположительная реакция Манту. В этом случае ценно сделать это малоинвазивное исследование до рентгенографии легких.

·  у пациентов, проходящих терапию подавляющую иммунитет, как например, глюкокортикостероидная  или лучевая терапия, пациенты находящиеся на диализном лечении,  с замещением функции почек;

·  при наличии хронических заболеваний, сопровождающихся снижением или истощением иммунитета, как например, ВИЧ инфекция , тяжелые формы   сахарного  диабета, или пневмокониозы;

·  при подозрении на внелегочные формы туберкулеза.

Внимание! Вакцинация БЦЖ не влияет на результаты теста T-SPOT ТВ.

КАК ПОДГОТОВИТЬСЯ К СДАЧЕ АНАЛИЗА

Кровь на Т-СПОТ ТВ можно сдать, по предварительной записи,  по  телефону регистратуры детской поликлиники   ГБУЗ ПК «КФМЦ Адрес: г. Пермь, ул.Металлистов, 9. Тел. (342) 206-34-01.

Обследования проводятся при наличии информированного согласия законных представителей несовершеннолетних детей.

  • Забор крови на исследование  проводится   в процедурном кабинете детской поликлиники   ГБУЗ ПК «КФМЦ»  г. Пермь, ул. Металлистов, 9. с  8-00  утра. 
  • За два часа до исследования нельзя есть. Кровь забирают из вены.
  • Результат проведенного исследования   можно получить через 4 дня.

ТРАКТОВКА РЕЗУЛЬТАТА АНАЛИЗА Т-СПОТТБ.

Результатом исследования могут быть два варианта ответа.

Чтобы понять, что значит каждый из них мы приводим расшифровку анализа Т-СПОТ:

  • Отрицательный результат теста  — организм вероятно не инфицирован туберкулёзом
  • Положительный результат теста  — организм инфицирован туберкулёзом, необходима консультация и обследование у  фтизиатра
  • В любом случае результат интерпретирует врач!!!

Сравнительная оценка инновационных тестов в диагностике латентной и активной туберкулезной инфекции у детей Текст научной статьи по специальности «Науки о здоровье»

УДК: 616-002.5-053.2

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИННОВАЦИОННЫХ ТЕСТОВ В ДИАГНОСТИКЕ ЛАТЕНТНОЙ И АКТИВНОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ

© М. Э. Лозовская, В. Б. Белушков, О. П. Гурина, Е. Б. Васильева, Л. В. Клочкова

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России

Резюме. У 50 детей изучены результаты новых трех тестов на основе антигенов CFP-10 и ESAT-6: внутрикожного теста Диаскинтест и тестов in vitro OUANTIFERON и Тубинферон. Диаскинтест и Тубинферон разработаны и выпускаются в Российской Федерации. Тест OUANTIFERON производится фирмой CeLLestis (Australia). У 20 детей были активные формы туберкулеза, у 22 латентная туберкулезная инфекция и 8 были не инфицированы M. tuberculosis. Установлено, что при высокой частоте совпадения результатов (66 %), в некоторых ситуациях тесты могут реагировать по-разному и давать дополнительную информацию при совместном применении в сложных диагностических случаях. Тесты in vitro оказались более чувствительными при иммунопатологических состояниях по сравнению с Диаскинтестом. Тест «Тубинферон» показал большую чувствительность при латентной туберкулезной инфекции (40,9 %) по сравнению с Диаскинтестом (22,7 %) и тестом OUANTIFERON (31,8 %), но меньшую при развившемся туберкулезе — 60, 80 и 85 % соответственно. Все три пробы более информативны при заболевании туберкулезом, чем при латентной туберкулезной инфекции. Важное преимущество теста «Тубинферон» — возможность оценки in vitro поствакцинальной аллергии, благодаря наличию пробы с туберкулином. Это может быть использовано при дифференциальной диагностике туберкулеза и генерализованной БЦЖ-инфекции, в том числе у детей с ВИЧ. У детей, не вакцинированных БЦЖ, проба Манту может быть эффективнее Диаскинтеста. Тест-система Тубинферон заслуживает широкого клинического применения, дальнейшего изучения и совершенствования.

Ключевые слова: дети; туберкулезная инфекция; Диаскинтест; OUANTIFERON; Тубинферон.

Одним из наиболее значимых научных достижений фтизиатрии за последние годы можно по праву считать открытие секреторных белков ESAT-6 и CFP-10, которые кодируются в зоне RD1 М. tuberculosis (МБТ) при размножении микобакте-рий [9, 10]. В связи с их отсутствием вМ. bovis BCG и большинстве микобактерий окружающей среды, оба эти белка были использованы за рубежом в создании тестов для диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза [11]. Наиболее распространенным из них является зарегистрированный в РФ «Квантиферон» или квантифероновый тест — QuantiFERON (QFT) (Cellestis, Australia), основанный на измерении продукции гамма-интерферона (IFN-y) Т-лимфоцитами крови in vitro в ответ на стимуляцию специфическими антигенами (Interferon-gamma release assay — IGRA) [8]. В нашей стране создан аллерген рекомбинантный для проведения внутрикожной пробы «Диаскинтест», представляющий собой два связанных между собой антигена: ESAT-6 и CFP-10 [2, 3]. Применение диаскинтеста (ДСТ) регламентировано Приказом Минздравсоц-развития России № 855 от 29 октября 2009 года [7], после чего он получил широкое распространение по всей стране [1, 5]. Помимо диаскинтеста российскими учеными разработана тест-система in vitro «Тубинферон» (ООО «МонА», Москва), близкая по принципу действия Квантиферону, но употребляемая не столь широко. Тубинфероновый тест (ТИТ) при значительно меньшей стоимости, по сравнению с QFT, позволяет in vitro дополнительно опреде-

лять уровень поствакцинальной аллергии (ПВА), поскольку помимо пробы с антигенами ЕБАТ-6 и СРР-10 включает пробу с традиционным туберкулином — РРD [4].

Цель исследования: сопоставление результатов ДСТ, QFT и ТИТ и пробы Манту с 2 ТЕ у детей с различными проявлениями туберкулезной инфекции, в том числе, при иммунопатологических состояниях, для уточнения их информативности и показаний к применению.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Методами QFT, ТИТ и ДСТ обследованы 50 детей, у которых имелись трудности при диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза. Возраст детей от 7 мес. до 15 лет: от 0 до 2 лет — 24 ребенка, 3-6 лет — 8 чел., 7-11 лет — 11 чел., с 12 до 15 лет — 7 детей. Для установления факта инфицирования детей МБТ пользовались общепринятыми во фтизиатрии критериями [6]. Вакцинацию против туберкулеза получили 47 детей (94,0 %), в том числе без формирования рубца — 8 (16,0 %), остальные 3 ребенка (6 %) не вакцинированы. Ревакцинированы БЦЖ 2 ребенка (4 %). Туберкулезный контакт (семейный, родственный) установлен у 21 ребенка (42 %), в том числе бациллярный — у 12 детей (24,0 %). Детям в условиях туберкулезного диагностического отделения проведено комплексное фтизиатрическое обследование, включающее помимо перечисленных тестов, постановку проб Манту с малыми дозами туберкули-

Таблица 1

Результаты тестов у детей, не инфицированных МБТ (п = 8)

Число наблюдений Манту 2 ТЕ дст OFT Тубинферон

ESAT-6, CFP-10 РРD

4 + — — — —

3 + — — — +

1 — — ± — +

на (0,01 ТЕ и 0,001 ТЕ), рентгено-томографическое исследование с проведением МСКТ по показаниям (62 % детей), УЗИ органов брюшной полости, фибробронхоскопию в показанных случаях. Всем детям проводилось стандартное бактериологическое обследование (посев на МБТ промывных вод бронхов и мочи). Бронхиальные смывы, взятые при ФБС, и ликвор, промывные воды желудка у тяжелых больных исследованы методом ПЦР и Bactec. Следует отметить, что бактериовыделение было обнаружено только у 1 ребенка в промывных водах бронхов (посев на плотную среду), и у одного — положительный результат ПЦР и Вас1ес из ликвора и промывных вод желудка. Кровь на QFT и ТИТ бралась одномоментно. Диаскинтест и индивидуальная диагностика проводились после тестов ш уйго. Окончательные диагнозы были установлены после комплексного фтизиатрического обследования и динамического наблюдения: у 20 детей — клинические формы туберкулеза различной степени тяжести (среди них — 2 ребенка с сочетанной инфекцией туберкулез-ВИЧ), у 3 детей посттуберкулезные изменения во внутригрудных лимфатических узлах (кальцинаты), 7 детей — туберкулезное инфицирование с прошлых лет (ТИ), 12 — ранний период первичной туберкулезной инфекции (РППТИ), 8 — не инфицированы МБТ.

РЕЗУЛЬТАТЫ

По итогам обследования не инфицированными МБТ признано 8 детей из 50. Среди них — 1 ребенок 4 лет и 7 детей до трех лет. Поводом для обследования у трех детей были заболевания: менингит неуточненной этиологии — 1, легочные процессы, требующие исключения туберкулеза — 2 (в том числе у 1 больного с ВИЧ-инфекцией 4-А стадии). В остальных случаях дети были направлены по результатам туберкулинодиагностики и по контакту с подозрением на туберкулез внутригрудных лимфатических узлов (ТВГЛУ). Туберкулезный контакт имел место у 3 детей: 1 ребенок — перинатальный контакт по туберкулезу и ВИЧ, 2 — разобщенные контакты по туберкулезу. Все 8 детей были привиты вакциной БЦЖ, у всех (кроме 1 ребенка, имевшего ВИЧ-инфекцию) были положительными пробы

Манту с 2 ТЕ. В результате обследования, по совокупности клинико-рентгенологических данных и лабораторных показателей, динамического наблюдения этих 8 детей данных в пользу заболевания туберкулезом и инфицирования МБТ не получено. Результаты тестов с ЕБЛТ-б и CFP-10 были следующими: ДСТ — отрицательный у всех 8 пациентов, QFT — отрицательный у 7, сомнительный у 1 (за счет низкого положительного контроля: пробы с митогеном). Сомнительный квантифероновый тест отмечался у ребенка с менингитом неуточненной этиологии, специфический характер которого в дальнейшем был исключен в связи с быстрой нормализацией ликвора. Тубинфероновый тест (ТИТ) дал отрицательный результат по пробе с ЕБЛТ-6 и CFP-10 у всех неинфи-цированных больных. Проба тубинферонового теста с РРD оказалась положительной у 4 из 8 неинфици-рованных, свидетельствуя о наличии ПВА (табл. 1).

Детей, тубинфицированных (ТИ) с прошлых лет, из групп повышенного риска оказалось 7 человек из 50 обследованных. Возраст детей составил от 5 до 15 лет, преобладали дети школьного возраста. Туберкулезный контакт (очаг смерти) был у одного ребенка. Все дети были направлены в стационар для исключения локальной формы туберкулеза, дифференциальная диагностика с неспецифическими заболеваниями требовалась в 2 случаях. У двух детей имелась сопутствующая хроническая неспецифическая патология легких (бронхиальная астма, постпневмонический пневмофиброз). У двух детей отмечалась гиперергическая чувствительность к туберкулину, у 1 ребенка — параспецифиче-ская реакция (кольцевидная гранулема). Изучаемые тесты показали следующие результаты (табл. 2).

Среди 7 детей, тубинфицированных с прошлых лет, у 2 детей (с гиперергической чувствительностью к туберкулину) все 3 теста с ЕБЛТ-6 и CFP-10 (ДСТ, QFT и ТИТ) были положительны, у 2 детей — все отрицательны, но чаще всего (у 3 из 7 детей) отрицательные результаты ДСТ и QFT сочетались с положительным тестом ТИТ. У всех детей, кроме одного, отмечалась и положительная проба Тубинферон-РРD.

Таблица 2

Результаты тестов у детей, инфицированных МБТ с прошлых лет из групп риска (п = 7)

Число наблюдений Манту 2 ТЕ дст OFT Тубинферон

ESAT-6, CFP-10 РРD

2 + + + + +

1 + — — — +

1 + — — — —

3 + — — + +

Таблица 3

Результаты тестов у детей в раннем периоде первичной туберкулезной инфекции (п = 12)

Число наблюдений Манту 2 ТЕ дст OFT Тубинферон

ESAT-6, CFP-10 PPD

1 + + + + +

1 + + + — —

1 + — + + +

1 + + — + —

1 + — — + —

1 — — + — —

3 + — — — +

1 + — + — —

2 + — — — —

Ранний период первичной туберкулезной инфекции (РППТИ) или вираж диагностирован у 12 детей (три ребенка младшего школьного возраста, остальные — до 3 лет). Туберкулезный контакт отмечался у 6 детей (с больным МБТ(+) у 4 детей). Результаты изучаемых тестов отражены в таблице 3.

Все три положительные теста (ДСТ, QFT и ТИТ) отмечались у 1 ребенка (мальчик 2 лет из очага туберкулезной инфекции с виражом и гиперергиче-ской чувствительностью к туберкулину). Все три отрицательные теста (ДСТ, QFT и ТИТ) оказались у 2 детей (также 2 лет, один из них из туберкулезного контакта, виражи с гиперергической чувствительностью к туберкулину). Обращает внимание тот факт, что ДСТ у 9 из 12 детей в РППТИ показал отрицательный результат. У этих диаскин-отрицательных пациентов в 1 случае были положительными оба теста ш уКго, и в трех случаях один из этих тестов (QFT или ТИТ). В целом складывается впечатление, что в РППТИ пробы ш уиго были более чувствительны по сравнению с ДСТ. У одного ребенка ран-

него возраста, при обследовании по туберкулезному контакту оказался положительным только кванти-фероновый тест, по которому и был диагностирован РППТИ, так как проба Манту у этого ребенка, также дала отрицательный результат.

У больных туберкулезом (20 детей от 7 мес. до 14 лет) клинические формы были следующими: туберкулез внутригрудных лимфатических узлов (ТВГЛУ) — 8, ТВГЛУ осложненного течения — 2, первичный туберкулезный комплекс (ПТК) — 2, туберкулезная интоксикация — 3, генерализованный туберкулез — 3 (в том числе — 2 в сочетании с ВИЧ), инфильтративный туберкулез и туберкуле -ма — по одному случаю. Результаты были следующими (табл. 4).

У 9 из 20 больных детей (45,0 %) все 3 изучаемых теста (ДСТ, QFT и ТИТ) были положительны, у 3 (15,0 %) детей не отреагировал ТИТ при положительных ДСТ и QFT. У всех 3 детей с генерализованным туберкулезом не отреагировал ДСТ при положительных QFT или ТИТ. У 2 (11,1 %) детей с доказанным туберкулезом была положительна только проба Манту с 2 ТЕ при отрицательных QFT, ТИТ и ДСТ. Так, у ребенка А., трех лет, не привитого вакциной БЦЖ, по виражу пробы Манту был выявлен ТВГЛУ в фазе начинающейся кальцинации. Все три теста с рекомбинант-ными антигенами были отрицательными. Таким образом, при отсутствии постановки пробы Манту с 2 ТЕ туберкулез у этого ребенка остался бы не выявленным.

У трех детей с посттуберкулезными изменениями (не активные кальцинаты в легочной ткани и внутригрудных лимфатических узлах) все пробы с антигенами ESAT-6 и CFP-10 дали отрицательный результат. Проба Манту с 2 ТЕ была отрицательной у 1 из трех детей с кальцинатами.

Таблица 4

Результаты тестов у детей больных туберкулезом (п = 20)

Число наблюдений Манту 2 ТЕ дст ESAT-6, и CFP-10 OFT ESAT-6, CFP-10 Тубинферон

ESAT-6, CFP-10 PPD

9 + + + + +

2 + + + — +

1 + + + + —

3 + + + — —

1 генерализованный ТВ — — — + (!) —

2 генерализованный ТВ — — + (!) — —

1 туберкулема + — — — —

1 ТВГЛУ (без БЦЖ) + — — — —

В целом среди 50 детей, обследованных тремя методами на основе антигенов ESAT-6 и CFP-10, процент совпадения результатов тестов составил: ДСТ и QFT — 90,0 %, ДСТ и ТИТ — 74,0 %, QFT и ТИТ — 68,0 %; все три теста совпали в 66,0 %. При расхождении ДСТ и теста с Тубинфероном (12 чел.): в 6 случаях отмечался положительный ТИТ при отрицательном ДСТ и в 6 случаях — наоборот. Первый вариант результатов тестов имел место у 5 детей инфицированных МБТ (из них 2 — в РППТИ) и одного ребенка с генерализованным туберкулезом на фоне ВИЧ. При втором варианте (положительный ДСТ при отрицательном ТИТ), напротив, у 5 детей было заболевание и у 1 — вираж.

При активной туберкулезной инфекции, у 20 больных активными формами туберкулеза положительные результаты тестов (чувствительность метода) составили: ДСТ — 80 % (положительный результат у 16 детей), QFT — 85 % (17 детей), ТИТ — 60 % (12 детей). Проба Манту с 2 ТЕ была положительной у 18 из 20 больных детей (90 %).

В группу «латентная туберкулезная инфекция» вошли 22 пациента: 7 детей, инфицированных с прошлых лет, 3 ребенка с неактивными кальцина-тами и 12 детей в раннем периоде первичной туберкулезной инфекции. Чувствительность тестов составила: ДСТ — 22,7 % (положительный результат у 5 детей), QFT — 31,8 % (7 детей), ТИТ — 40,9 % (9 детей). Проба Манту имела чувствительность 90,9 % (положительный результат у 20 детей) при латентной туберкулезной инфекции. Вместе с тем у неинфицированных детей специфичность тестов с ESAT-6 и CFP-10 составляет 100 % (отрицательных результатов), тогда как проба Манту мало информативна за счет поствакцинальной аллергии.

выводы

1. Тесты на основе антигенов ESAT-6 и CFP-10: Диаскинтест, Квантиферон, Тубинферон — при высокой частоте совпадения результатов, в некоторых ситуациях могут реагировать по-разному и давать дополнительную информацию при совместном применении в сложных диагностических случаях.

2. Тесты in vitro (QFT и ТИТ) оказались более чувствительными при иммунопатологических состояниях по сравнению с ДСТ.

3. Тест «Тубинферон» показал большую чувствительность при латентной туберкулезной инфекции (40,9 %) по сравнению с ДСТ (22,7 %) и QFT (31,8 %), но меньшую при развившемся туберкулезе — 60, 80 и 85 % соответственно. Все три пробы более информативны при заболевании туберкулезом, чем при латентной туберкулезной инфекции.

4. Важное достоинство теста «Тубинферон» — возможность оценки in vitro поствакцинальной аллергии, благодаря присутствию пробы с PPD. Это может быть использовано при дифференциальной диагностике туберкулеза и генерализованной БЦЖ-инфекции, в том числе у детей с ВИЧ.

5. У детей, не вакцинированных БЦЖ, проба Манту может быть эффективнее ДСТ.

6. Тест-система Тубинферон заслуживает широкого клинического применения, дальнейшего изучения и совершенствования.

ЛИТЕРАТУРА

1. Аксенова В.А., Клевно Н. И., Барышникова Л. А. и др. Выявление туберкулеза и тактика диспансерного наблюдения за лицами из групп риска с использованием рекомбинантного туберкулезного аллергена — диаскинтест: Метод. рекомендации // МЗ и СР РФ. — М., 2011. -20 с.

2. Киселев В. И., Барановский П. М., Рудых И. В. и др. Клинические исследования нового кожного теста «диаскинтест» для диагностики туберкулеза // Туберкулез и болезни легких. — 2009. — № 2. — С. 11-16

3. Кожная проба с препаратом «Диаскинтест» — новые возможности идентификации туберкулезной инфекции / Под ред. академика РАН и РАМН М. А. Пальце-ва — М.: Шико, 2011. — 256 с.

4. Мордовская Л. И., Владимирский М.А., Аксенова В. А. и др. Индукция интерферона-гамма в образцах цельной крови in vitro — тест для определения туберкулезного инфицирования детей и подростков // Проблемы туберкулеза и болезней легких. -2009. — № 6. — С. 19-24.

5. Овсянкина Е. С., Губкина М. Ф., Ершова Н. Г. и др. Опыт применения нового кожного теста (диаскинтеста) для диагностики туберкулеза органов дыхания у детей и подростков в туберкулезном отделении // Туберкулез и болезни легких. — 2010. — № 1. -С. 16-19.

6. Приказ Минздрава России от 21.03.2003 г. № 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации».

7. Приказ Минздравсоцразвития России от 29.10.2009 г. № 855 «О внесении изменения в приложение № 4 к приказу Миздрава России от 21 марта 2003 г. № 109».

8. СлогоцкаяЛ. В., Кочетков Я.А, Иванова Д.А. и др. Сравнительные результаты кожного теста с препаратом, содержащимрекомбинантныйбелокCFP-10-ESAT-6, и лабораторного теста OUANTIFERON // Всероссийская научно-практическая конф. «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом»: Материалы. — СПб., 2011. — С. 379-381.

9. Arend S., Andersen P., van Meijaarden K. et al. Detection of active tuberculosis infection by T cell responses to early-secreted anti-genic target 6-kDa protein and culture filtrate protein 10 // J. Infect. Dis. — 2000. -Vol. 181. — P. 1850-1854.

10. Berthet F.X, Rasmussen P.B., Rosenkrands I. et al. Mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT-6 and novel low-molecular-mass culture filtrate protein (CFP-10) // Microbiologi. — 1998. — Vol. 144 (Pt 11). -P. 3195-3203.

11. Mazurek G., JerebJ., Lobue P. et al. Guidelines for using the OuantiFeron-TB Gold test for detecting Mycobacterium tuberculosis infection // United States. MMWR Recomm. Rep. — 2005. — Vol. 54. — P. 49-55.

COMPARATIVE EVALUATION OF INNOVATIVE DIAGNOSTIC TESTS FOR LATENT AND ACTIVE TBINFECTION IN CHILDREN

Lozovskaya M. E., Belushkov V. B., Gurina O. P., Vasilyeva Ye. B, Klochkova L. V.

♦ Resume. The results of three new tests based on antigens CFP-10 and ESAT-6 were studied in 50 children: intradermal Diaskintest and tests in vitro OUANTIFERON and Tubinferon.

Diaskintest and Tubinferon are developed and produced in the Russian Federation. OUANTIFERON test is performed by Celles-tis (Australia). 20 children had active TB, 22 children had latent TB infection, and 8 were not infected by M. tuberculosis. It has been established that while the frequency of coincidence of the results is high (66 %), in some situations, tests may react differently and give additional information when used together in difficult diagnostic cases. In vitro tests were more sensitive compared with Diaskinintest in immunopathological conditions. Tubinferon test had higher sensitivity in latent TB infection (40.9 %) compared to Diaskintest (22.7 %) and OUANTIFERON test (31,8 %), but lower sensitivity in developed tuberculosis -60, 80 and 85 % respectively. All three tests are more informative in TB disease than in latent TB infection. An important advantage of the Tubinferon test is the ability to evaluate in vitro postvaccinal allergy, due to presence of the sample with the tuberculin. This can be used in the differential diagnostic between tuberculosis and generalized BCG infection, including children with HIV. Mantoux test may be more effective then Diaskintest in children who was not vaccinated with BCG. Tubinferon test system deserves wide clinical application, further study and development.

♦ Key words: children; TB infection; Diaskintest; OUANTIFERON; Tubinferon.

♦ Информация об авторах

Лозовская Марина Эдуардовна — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой фтизиатрии. ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России. 194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, д. 2. Е-тшН: [email protected]

Lozovskaya Marina Eduardovna — MD, PhD, Dr Med Sci, Professor, Head of Department of Phthisiatry. Saint-Petersburg State Pediatric Medical University. 2, Litovskaya St., St. Petersburg, 194100, Russia. E-mail: [email protected]

Белушков Вячеслав Валерьевич — аспирант кафедры фтизиатрии. ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России. 194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, д. 2. Е-тшН: [email protected]

Гурина Ольга Петровна — канд. мед. наук, старший научный сотрудник, заведующая лабораторией клинической иммунологии научно-исследовательского центра. ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России. 194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, д. 2. Е-тшН: [email protected]

Belushkov Vyacheslav Valeryevich — Postgraduate Student of Department of Phthisiatry. Saint-Petersburg State Pediatric Medical University. 2, Litovskaya St., St. Petersburg, 194100, Russia. E-mail: [email protected]

Gurina Olga Petrovna — MD, PhD, Senior Researcher, Head of the Laboratory of Clinical Immunology Research Center. Saint-Petersburg State Pediatric Medical University. 2, Litovskaya St., St. Petersburg, 194100, Russia. E-mail: [email protected]

Васильева Елена Борисовна — канд. мед. наук, доцент, кафедра фтизиатрии. ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России. 194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, д. 2. Е-тшН: [email protected]

Vasilyeva Yelena Borisovna — MD, PhD, Associate Professor, Department of Phthisiatry. Saint-Petersburg State Pediatric Medical University. 2, Litovskaya St., St. Petersburg, 194100, Russia. E-mail: [email protected]

Клочкова Людмила Владимировна — канд. мед. наук, доцент, кафедра фтизиатрии. ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России. 194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, д. 2. Е-тшН: [email protected]

Klochkova Lyudmila Vladimirovna — MD, PhD, Associate Professor, Department of Phthisiatry. Saint-Petersburg State Pediatric Medical University. 2, Litovskaya St., St. Petersburg, 194100, Russia. E-mail: [email protected]

SPOT.TB — Диагностика латентной и активной туберкулезной инфекции. Т спот тест

Туберкулёз — широко распространённое в мире инфекционное заболевание, вызываемое микобактериями M. tuberculosis и другими близкородственными видами.

Каждый четвертый человек на улице – носитель латентного туберкулеза, скрытой формы заболевания, которая в любой момент может перейти в активную форму По данным ВОЗ Россия занимает 20-е место по числу новых случаев туберкулезной инфекции

Попав в организм, микобактерия туберкулеза не всегда приводит к развитию заболевания. Наиболее часто при достаточном уровне иммунитета и влиянии ряда других факторов бактерия элиминируется из организма. Реже развивается латентная инфекция, которая характеризуется отсутствием клинической картины туберкулеза.

Вероятность развития активной формы заболевания у носителя латентной инфекции составляет около 10%. Этому, в первую очередь, способствует общее состояние организма, а именно вероятность увеличивается при наличии хронических инфекций, снижающих иммунитет. Заболевание может длительно протекать бессимптомно, что существенно затрудняет диагностику туберкулеза.

T-SPOT.TB – инновационный тест диагностики туберкулеза по анализу крови, является ведущим для выявления инфекции в случае отсутствия ее симптомов. При получении неоднозначных результатов кожных тестов (Манту, Диаскинтест), а также в случае отказа родителей или законных представителей ребенка от проведения внутрикожных проб, возможно назначение альтернативных методов обследования с целью исключения туберкулеза у ребенка.

Анализ на T-SPOT.TB – иммунологический тест на туберкулезную инфекцию, основанный на высвобождении Т-лимфоцитами гамма-интерферона в ответ на стимуляцию антигенами ESAT-6 и CFP-10. Тест может использоваться при проведении скрининга среди пациентов, относящихся к группам риска по развитию туберкулезной инфекции. Кроме того, T-SPOT.TB тест может использоваться в качестве дополнительного диагностического метода при обследовании пациентов с подозрением на развитие активной формы заболевания. Тест указан в рекомендательных документах Американской торакальной ассоциации (ATS), Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC), а также в Клинических рекомендациях Российского общества фтизиатров (2017г). Суть диагностики заключаются в том, что в отличие от кожной пробы (Манту и “Диаскин” тест), при данном исследовании в организм не вводят антигены опасных микобактерий.

Тестирование лекарственной чувствительности при туберкулезе: методы и достоверность результатов

Реферат

Спрос на надежные тесты на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) возрастает с расширением эпиднадзора за противотуберкулезной лекарственной устойчивостью и с необходимостью надлежащего лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, заболеваемость которым постепенно увеличивается во многих частях мира. Однако надежность результатов ТЛЧ, полученных с помощью широко используемых методов, не соответствует приемлемым уровням, за исключением ТЛЧ к изониазиду и рифампицину.

В целом, результаты восприимчивости очень предсказуемы, в то время как результаты резистентности показывают низкую прогностическую ценность, когда распространенность резистентности составляет <10%. Низкая надежность проистекает из слабой корреляции с клиническим ответом и низкой воспроизводимости из-за плохой стандартизации сложных и хрупких процедур тестирования. Следовательно, критериев устойчивости in vitro для тестирования на чувствительность следует тщательно определять с использованием репрезентативных клинических образцов Mycobacterium tuberculosis , выделенных от пациентов, никогда не получавших никаких противотуберкулезных препаратов, и от пациентов, не прошедших лечение по схеме, содержащей исследуемый препарат; Затем следует тщательно стандартизировать ТЛЧ для получения воспроизводимых результатов.

Критическая концентрация некоторых лекарств близка к минимальной ингибирующей концентрации для чувствительных к диким штаммам штаммов, и, таким образом, тестирование на лекарственную чувствительность может дать плохо воспроизводимые результаты. Эти вопросы требуют внимания врачей при использовании результатов тестирования лекарственной чувствительности для ведения случая.

Во многих странах широкое использование стандартного краткосрочного курса лечения привело к увеличению заболеваемости туберкулезом (ТБ) с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), определяемым как устойчивость как минимум к изониазиду (INH) и рифампицину (RFP) 1– 3.Значительно высокие показатели МЛУ-ТБ наблюдались в некоторых частях мира не только среди ранее леченных больных ТБ из-за плохого ведения больных, но и среди новых случаев из-за передачи в обществе. Ситуация превратилась в острую потребность в тестировании на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) для проведения эпиднадзора за лекарственной устойчивостью (DRS), а также для разработки эффективных схем лечения отдельных случаев. СЕРИЯ «СПОРНЫЕ ВОПРОСЫ ТУБЕРКУЛЕЗА» Под редакцией А.Торрес и Дж. Каминеро номер 4 в этой серии

В результате несоответствующего и / или неадекватного лечения возникает лекарственная устойчивость в результате селективного размножения устойчивых мутантов в очагах поражения, несмотря на присутствие ингибирующих рост концентраций лекарства. Частота мутантов, устойчивых к лекарственным средствам, и их уровни устойчивости варьируются в зависимости от лекарственного средства и мутировавших генов и сайтов, фенотипические проявления которых включают следующее: изменения сайта связывания молекул-мишеней лекарственного средства; потеря ферментов, активирующих молекулы лекарства; изменения проницаемости для препарата, в том числе отток; и производство ферментов, инактивирующих лекарственное средство, таких как β-лактамаза.Существует множество методов определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам, но ни один из них не идеален, и их результаты не удовлетворяют врачей с точки зрения эффективного лечения больных туберкулезом.

Большинство применяемых в настоящее время методов ТЛЧ страдают от низкой предсказуемости, связанной с клинической несущественностью результатов, и с неприемлемо низкой надежностью из-за плохой воспроизводимости. В этом обзоре основное внимание уделяется общим характеристикам методов ТЛЧ, касающихся клинической значимости и воспроизводимости метода.

МЕТОДЫ ТЕСТИРОВАНИЯ НА ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ

Лекарственная чувствительность M. tuberculosis может быть определена либо путем наблюдения за ингибированием роста или метаболизма в среде, содержащей противотуберкулезный препарат, либо путем обнаружения на молекулярном уровне мутаций в генах, связанных с действием лекарственного средства. С технической точки зрения чувствительность к лекарственным средствам определяется на основе ингибирования роста (или метаболизма), индуцированного лекарственным средством, посредством: 1) макроскопического наблюдения роста в средах, не содержащих лекарственного средства и содержащих лекарственное средство; 2) обнаружение или измерение метаболической активности или продуктов; 3) лизис микобактериофагом; и 4) обнаружение генетических мутаций с использованием молекулярных методов.

Традиционные методы культивирования с использованием сред на основе яиц или агара по-прежнему наиболее широко используются во многих странах 4, 5. Хотя длительное время обработки результатов ТЛЧ вызывает недовольство врачей с точки зрения ведения случаев, они подходят для DRS. Стандартные методы с использованием среды Левенштейна-Йенсена включают метод пропорции, метод абсолютной концентрации и метод соотношения резистентности, которые достаточно хорошо стандартизированы с клиническими образцами, по крайней мере, для основных противотуберкулезных препаратов 4.Среди традиционных методов наиболее предпочтительным является метод пропорционального распределения, но также обычно используется метод абсолютного концентрирования из-за его технической простоты для приготовления посевного материала и считывания результатов.

Чтобы сократить время обработки и сделать его более удобным для ведения пациентов, появилось множество новых методов, направленных на выявление задержки роста как можно раньше. Чаще всего используются системы обнаружения производства CO 2 , такие как BACTEC 460 6 или MB / Bact 7, и потребления кислорода, такие как пробирка индикатора роста микобактерий 8; есть и другие, находящиеся на стадии развития, такие как окислительно-восстановительные индикаторы, такие как резазурин или тетразолий бромид 9, 10 и методы на основе фагов 11, 12.Иммуноанализ 13 с подсчетом частиц также может сократить время обработки, обнаруживая низкоуровневое размножение M. tuberculosis . Многие из этих новых методов трудно внедрить в странах, где они больше всего нужны, из-за высокой стоимости, технической сложности и отсутствия должным образом подготовленных человеческих ресурсов. Кроме того, они все еще нуждаются в клинической оценке, чтобы подтвердить заявленную эффективность в различных условиях. Более того, ни один из этих методов не был хорошо откалиброван на репрезентативных клинических образцах M.tuberculosis для определения клинически значимых критериев устойчивости (, т. е. пороговых значений).

Имеются многочисленные сообщения о молекулярных методах обнаружения генных мутаций, связанных с устойчивостью, включая гибридизацию 14–20 амплифицированных генных сегментов или другие методы, основанные на ПЦР. Однако не все гены, связанные с устойчивостью к различным противотуберкулезным препаратам, и их участки мутации были обнаружены, за исключением мутаций гена rpoB, которые приводят к устойчивости к RFP.Эти молекулярные методы обычно требуют первичной амплификации, и поэтому, когда они используются на регулярной основе в течение длительных периодов времени, они не свободны от ложных результатов из-за загрязнения ампликонов и / или хромосомной ДНК.

НАДЕЖНОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ ИСПЫТАНИЙ НА ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ

Всемирная организация здравоохранения и Международный союз борьбы с туберкулезом и легочными заболеваниями создали наднациональную сеть референс-лабораторий по туберкулезу, через которую они намереваются обеспечить проверку квалификации в отношении ТЛЧ в странах, внедряющих DRS 1–3.Результаты квалификационных испытаний девяти раундов, проведенных в течение 1994–2002 годов, показали, что средняя чувствительность для выявления устойчивости к INH, RFP, стрептомицину (SM) и этамбутолу (EMB) составляла 98,7%, 97,2%, 90,8% и 89,3% соответственно 3. Соответствующие значения чувствительности для определения чувствительности к INH, RFP, SM и EMB составили 98,5%, 96,8%, 93,9% и 94,0% соответственно. 3. Прогностические значения результатов ТЛЧ к чувствительности, которые были рассчитаны на основе вышеупомянутых цифр. , были высокими для всех четырех препаратов (> 93%) даже при 40% распространенности, в то время как прогностическая ценность результатов ТЛЧ к устойчивости сильно различалась между четырьмя основными препаратами (рис. 1⇓ и 2⇓).При распространенности резистентности ниже 10% прогностические значения для EMB и SM были значительно ниже, чем для INH и RFP. Прогностическая ценность устойчивости при средней распространенности устойчивости к конкретным препаратам среди больных туберкулезом легких, как было опубликовано ранее 3, составляла 80,6% для INH при медианной распространенности резистентности 5,9%, 30,4% для RFP при 1,4%, 50,0 % для SM — 6,3% и 10,4% для EMB — 0,8%. Среди ранее леченных случаев прогностическая ценность, конечно, была выше из-за более высокой средней распространенности резистентности, а именно: 91.6% для INH при средней распространенности 14,4%; 74,6% для запроса предложений на уровне 8,4%; 65,8% для SM — 11,4%; и 34,8% для ИБП на уровне 3,5%. Ясно, что результаты сопротивления для EMB и SM менее надежны, чем для INH и RFP. Аналогичные результаты были получены с помощью систем быстрого обнаружения роста 8.

Рис. 1—

Прогностические значения результатов тестов на чувствительность к изониазиду (INH) и стрептомицину (SM). ○: чувствительность к INH; •: сопротивление INH; ⋄: восприимчивость к СМ; ♦: сопротивление SM. Данные взяты из 3.

Рис.2–

Прогностические значения результатов тестов на чувствительность к рифампицину (RFP) и этамбутолу (EMB). □: восприимчивость к RFP; ▪: сопротивление RFP; ▵: восприимчивость к ЭМБ; ▴: сопротивление EMB. Данные взяты из 3.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ НА ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ

Методы ТЛЧ и интерпретация их результатов сильно различаются; однако следует отметить, что для получения клинически значимых и надежных результатов для ведения случая вероятность ошибочной классификации клинически чувствительных или клинически устойчивых штаммов должна быть минимальной или отсутствовать.Для выполнения этого требования было предложено установить критерии на минимальной ингибирующей концентрации (МИК) и 1% критической устойчивой доли штаммов M. tuberculosis , выделенных от никогда не лечившихся пациентов 4, 21. Однако первичный лекарственная устойчивость, в том числе естественная, помешала бы этому подходу. Другой метод — это сравнение клинических ответов штаммов, обладающих всеми возможными уровнями устойчивости, с целью определения клинически значимого критического уровня устойчивости.Такой подход может показаться идеальным, но он нереалистичен. По этой причине рекомендуется определить критериев in vitro , которые можно использовать для прогнозирования клинической устойчивости и восприимчивости с приемлемой точностью, путем тестирования четко определенных и репрезентативных клинических штаммов M. tuberculosis 4, 22, выделенных от пациентов. лечиться в хорошо контролируемых и должным образом зарегистрированных клинических условиях. Оцениваемый метод ТЛЧ должен быть откалиброван путем сравнения МИК потенциально чувствительных (PS) штаммов, полученных от никогда не лечившихся пациентов, с МИК вероятно устойчивых (PR) штаммов, полученных от пациентов, у которых очевидно неэффективность лечения, с режимами, содержащими соответствующий препарат.Разница в процентах кумулятивной чувствительности между клиническими изолятами PS и PR (при различных концентрациях) была больше при 0,2 мкг · мл -1 с INH и 40,0 мкг · мл -1 с RFP 23; Значения селективной способности составили 75,8% и 85,8% соответственно (рис. 3⇓ и 4⇓). При одинаковых концентрациях доля критической резистентности 1% может наиболее разумно различать PS и PR для обоих препаратов, показывая способность различения 77,1% для INH и 85,6% для RFP 23. Mitchison 24 обнаружил, что SM-устойчивые штаммы отличались от чувствительных. штаммы при 16 мкг · мл -1 с разницей 52.4%. Lefford и Mitchison 22 сообщили, что устойчивость к этионамиду (ETH) была определена при 40,0 мкг · мл -1 с разницей в 46,7%. Также интересно отметить, что наиболее разумные критерии устойчивости могут различаться в разных лабораториях, даже если они применяют один и тот же метод. Штаммы EMB PR были выделены из штаммов PS при концентрации 2 мкг · мл −1 в лаборатории Корейского института туберкулеза, Сеул, Южная Корея, в то время как в лаборатории они были лучше различены при концентрации 4 мкг · мл −1 . Королевской медицинской школы последипломного образования, Лондон, Великобритания, используя ту же среду и метод, и тестируя те же штаммы PR (личное сообщение, Д.A. Mitchison, Отдел лабораторных исследований туберкулеза Совета медицинских исследований, Королевская медицинская школа последипломного образования, больница Хаммерсмит, Лондон, Великобритания; инжир. 5⇓). Эти данные, по-видимому, указывают на то, что различия в критических концентрациях могли быть результатом разных уровней восприимчивости штаммов PS и различий в тестовой среде. Уровни устойчивости PR-штаммов сильно различаются, за исключением RFP; следовательно, невозможно определить разумную точку отсечения без тщательной калибровки чувствительности с помощью штаммов PS.Эти исследования ясно показывают, что различие между штаммами PR и PS более надежно для INH и RFP, чем для других препаратов. Также очевидно, что разработка метода ТЛЧ, способного на 100% различать штаммы PR и PS, фактически неосуществима из-за технических вариаций, возникающих из-за физико-химически лабильной среды испытания.

Рис. 3–

Определение а) критической концентрации и б) критической доли резистентности для изониазида (INH) с использованием вероятно чувствительных (——; n = 99) и, возможно, устойчивых штаммов (сплошная линия; n = 117 ).МИК: минимальная ингибирующая концентрация. # : 13,1% по стойкости; : 75,8%; + : 11,1% как восприимчивые; § : 77,1%. Данные взяты из 23.

Рис. 4–

Определение а) критической концентрации и б) критической доли устойчивости к рифампицину (RFP) с использованием вероятно чувствительных (——; n = 99) и, вероятно, устойчивых штаммов (твердых линия; n = 108). МИК: минимальная ингибирующая концентрация. # : 85,8%; : 85,6%. Данные взяты из 23.

Рис. 5–

Сравнение критических концентраций этамбутола, наблюдаемых в лабораториях а) Корейского института туберкулеза, Сеул, Южная Корея (вероятно, чувствительные корейские штаммы: ——, n = 104; вероятно, устойчивые британские штаммы ( BPR): сплошная линия, n = 124), и b) Королевская медицинская школа последипломного образования, Лондон, Великобритания (вероятно, восприимчивые гонконгские штаммы: ·····, n = 333; BPR: n = 106), применяя то же метод. МИК: минимальная ингибирующая концентрация. : 41.9%; : 38,8%. Данные получены из личного общения с Д.А. Митчисон (Отделение лабораторных исследований туберкулеза Совета медицинских исследований, Королевская медицинская школа последипломного образования, больница Хаммерсмит, Лондон, Великобритания).

Недавнее исследование существующей практики ТЛЧ к препаратам второго ряда в 10 наднациональных справочных лабораториях выявило важные различия в отношении критических концентраций препаратов и критических пропорций устойчивости 25, подчеркнув необходимость стандартизации методов и критериев с учетом цель оптимизации клинической значимости результатов ТЛЧ.

Развитие лекарственной устойчивости путем селективного размножения устойчивых мутантов, существующих в дикой популяции бациллов, определяется начальным размером активно размножающихся организмов в очагах поражения, временем воздействия лекарственного средства и концентрацией лекарственного средства 4, 24, 26, 27. Абсорбция, диффузия в очаги поражения и поддерживаемый уровень лекарственного средства — все это важные факторы для возникновения лекарственной устойчивости. INH и RFP, чьи результаты тестирования чувствительности достаточно надежны, показывают пиковую концентрацию сыворотки более чем в 100 раз выше, чем MIC, и, безусловно, можно поддерживать их на довольно высоком уровне в поражениях на протяжении всего лечения, если пациент не прервет прием лекарств (рис.6⇓) 27, 28. И наоборот, пиковые уровни в сыворотке циклосерина, EMB, ципрофлоксацина, офлоксацина и ETH ближе к МПК (рис. 6⇓). Как следствие, у некоторых пациентов период ингибирующей концентрации лекарственного средства в очагах поражения может быть коротким и / или уровень лекарственного средства может оставаться субингибирующим в течение большей части времени. В целом результаты ТЛЧ к последним препаратам невысоки.

Рис. 6—

Приблизительное отношение среднего пика сыворотки к минимальной ингибирующей концентрации (МИК) противотуберкулезных препаратов.Данные представлены как среднее (высокое / низкое). ▪: ципрофлоксацин; □: офлоксацин; •: этионамид; ○: этамбутол; ♦: изониазид; ⋄: циклосерин; ▴: рифампицин; ▵: стрептомицин; ▾: пара-аминосалициловая кислота; ▿: капреомицин; : канамицин. Данные взяты из 27, 28.

Многие из недавно разработанных методов ТЛЧ не были тщательно откалиброваны для определения критериев устойчивости in vitro с соответствующими клиническими образцами, репрезентативными для клинического исхода пациента в текущих клинических условиях; вместо этого эти критерии часто выбирались произвольно с использованием лабораторных штаммов.Если не будет проведена тщательная калибровка, клиническая значимость результатов ТЛЧ остается неопределенной.

Воспроизводимость результатов in vitro ТЛЧ в значительной степени зависит от физико-химической среды теста 4, 28, что требует соответствующей стандартизации и контроля процедуры тестирования. Плохая воспроизводимость обычно связана с процедурной сложностью; таким образом, его можно улучшить за счет процедурного упрощения.

Соответствующая стандартизация приготовления посевного материала является важной предпосылкой для получения надежных результатов ТЛЧ, поскольку количество (размер), дисперсия и жизнеспособность микроорганизмов в посевном материале оказывают значительное влияние на результаты ТЛЧ.Частые субкультуры могут исказить уровни лекарственной чувствительности и характер штаммов по сравнению с таковыми из первичных культур. Питательные среды должны обеспечивать адекватный рост всех инокулированных организмов; однако, когда они содержат некоторые антагонистические соединения или химические вещества, мешающие действию лекарства, результаты будут ненадежными, если эти вещества не будут удалены или сведены к минимуму. Вариации в концентрации лекарственного средства, введенного в среду, происходят из-за связывания с белками, тепловой инактивации, потери различных количеств лекарства во время стерилизации фильтром, неполного растворения из-за использования неподходящих растворителей, неточного расчета активности и неточного разбавления.Средний pH, температура инкубации и время инкубации также являются важными факторами, влияющими на результаты ТЛЧ. Тщательная стандартизация и контроль этих физико-химических факторов тестовой среды необходимы для достижения приемлемой воспроизводимости результатов ТЛЧ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Тестирование лекарственной чувствительности по-прежнему широко используется в качестве инструмента для выбора эффективных схем успешного лечения больных туберкулезом (особенно туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью), а также для оценки эффективности программ и разработки стратегий решения проблемы наркотиков. -резистентный туберкулез.Однако для получения надежных результатов метод тестирования лекарственной чувствительности, оцениваемый для рутинного использования, должен быть тщательно откалиброван с репрезентативными клиническими изолятами штаммов Mycobacterium tuberculosis , чтобы определить критерии теста in vitro , которые можно использовать для прогнозирования , в лучшем случае, клинический исход пациента. Затем процедура испытания должна быть стандартизирована с максимальным упрощением, чтобы получить результаты с приемлемой воспроизводимостью по этим критериям.

Сноски

  • Предыдущие статьи в этой серии: № 1: Cardona P-J, Ruiz-Manzano J. О природе Mycobacterium tuberculosis -латентных бацилл. Eur Respir J 2004; 24: 1044–1051. No. 2: Rieder H. Годовой риск заражения Mycobacterium tuberculosis . Eur Respir J 2005; 25: 181–185. № 3: Mitchison DA. Лекарственная устойчивость при туберкулезе. Eur Respir J 2005; 25: 376–379.

  • Получено 25 сентября 2004 г.
  • Принято 6 октября 2004 г.

Список литературы

  1. Всемирная организация здравоохранения. Устойчивость к противотуберкулезным препаратам в мире. Глобальный проект ВОЗ / IUATLD по надзору за устойчивостью к противотуберкулезным препаратам (WHO / TB / 97.229). Женева, Документ Всемирной организации здравоохранения, 1997 г.

  2. Всемирная организация здравоохранения. Устойчивость к противотуберкулезным препаратам в мире.Отчет № 2: распространенность и тенденции. Глобальный проект ВОЗ / IUATLD по надзору за устойчивостью к противотуберкулезным препаратам (WHO / CDC / TB / 2000.278). Женева, документ Всемирной организации здравоохранения, 2000 г.

  3. Всемирная организация здравоохранения. Устойчивость к противотуберкулезным препаратам в мире. Третий глобальный отчет. Глобальный проект ВОЗ / IUATLD по надзору за устойчивостью к противотуберкулезным препаратам (WHO / CDC / TB / 2004). Женева, документ Всемирной организации здравоохранения, 2004 г. (в печати)

  4. Канетти Г., Фокс В., Хоменко А., и др. Достижения в области методов тестирования чувствительности к микобактериальным препаратам и использования тестов на чувствительность в программах борьбы с туберкулезом. Bull World Health Organ 1969; 41: 21–43.

  5. Kent TK, Kubica GP. Микобактериология общественного здравоохранения. Руководство для лаборатории III уровня. Атланта, Центр по контролю за заболеваниями, 1985

  6. Хокинс Дж. Э., Уоллес Р. Дж. Младший, Браун Б. А. Тесты на чувствительность к антибактериальным препаратам: микобактерии. In : Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadommy HJ, ред. Руководство по клинической микробиологии. 5-е изд. Вашингтон, округ Колумбия, Американское общество микробиологии, 1991; стр. 1138–1152

  7. Diaz-Infantes MS, Руис-Серрано MJ, Martinez-Sanchez L, et al. Оценка системы обнаружения микобактерий MB / BacT для тестирования чувствительности Mycobacterium tuberculosis . J Clin Microbiol 2000; 38: 1988–1989.

  8. Bemer P, Palicova FR, Rusch-Gerdes S, Drugeon HB, Pfyffer GE.Многоцентровая оценка полностью автоматизированной системы BACTEC Mycobacteria Growth Indicator Tube 960 для тестирования чувствительности Mycobacterium tuberculosis . J Clin Microbiol 2002; 40: 150–154.

  9. Palomino JC, Martin A, Camacho M, Guerra H, Swings J, Portaels F. Микротитровальный планшет с резазурином: простой и недорогой метод определения лекарственной устойчивости у Mycobacterium tuberculosis . Противомикробные агенты Chemotherap 2002; 46: 2720–2722.

  10. Abate G, Mshana RN, Miörner H. Оценка колориметрического анализа на основе 3- (4,5-диметил-2-ил) -2,5-дифенилтетразолия бромида для быстрого выявления устойчивости к рифампицину у Mycobacterium tuberculosis . Int J Tuberc Lung Dis 1998; 2: 1011–1016.

  11. Риска П.Ф., Су Ы, Бардаров С, и др. Быстрое определение чувствительности к антибиотикам штаммов Mycobacterium tuberculosis на основе пленки с использованием фага-репортера люциферазы и бокса Bronx.J Clin Mirobiol 1999; 37: 1144–1149.

  12. Гали Н., Домингес Дж., Бланко С., и др. Использование собственного анализа на основе микобактериофагов для быстрого определения устойчивости к рифампицину в клинических изолятах Mycobacterium tuberculosis . J Clin Microbiol 2003; 41: 2647–2649.

  13. Drowart A, Cambiaso CL, Huygen K, et al. Определение устойчивости к рифампицину и изониазиду штаммов Mycobacterium tuberculosis методом иммуноферментного анализа.Int J Tuberc Lung Dis 1997; 1: 284–288.

  14. Lebrun L, Gönüllü N, Boutros N, et al. Использование анализа INNO-LIPA для быстрой идентификации микобактерий. Диагностика Microbiol Infect Dis 2003; 46: 151–153.

  15. El-Haji HH, Marras SAE, Tyagi S, Kramer FR, Alland D. Обнаружение устойчивости к рифампицину у Mycobacterium tuberculosis в одной пробирке с молекулярными маяками.J Clin Microbiol 2001; 39: 4131–4137.

  16. Ким Б.Дж., Ли К.Х., Парк Б.Н., и др. Выявление устойчивых к рифампицину Mycobacterium tuberculosis в мокроте с помощью вложенного ПЦР-связанного однонитевого конформационного полиморфизма и секвенирования ДНК. J Clin Microbiol 2001; 39: 2610–2617.

  17. Lin YP, Behr MA, Small PM, Kurn N. Генотипическое определение устойчивости к антибиотикам Mycobacterium tuberculosis с использованием нового метода обнаружения мутаций, ингибирования миграции ветвей M.tuberculosis тест на устойчивость к антибиотикам. J Clin Microbiol 2000; 38: 3656–3662.

  18. Мокроусов И, Оттен Т, Филипенко М, и др. Обнаружение устойчивых к изониазиду штаммов Mycobacterium tuberculosis с помощью мультиплексного аллель-специфичного ПЦР-анализа kat Вариант кодона 315 G. J Clin Microbiol 2002; 40: 2509–2512.

  19. Torres MJ, Criado A, Palomares JC, Aznar J.Использование ПЦР в реальном времени и флуориметрии для быстрого обнаружения мутаций, связанных с устойчивостью к рифампину и изониазиду, у Mycobacterium tuberculosis . J Clin Microbiol 2000; 38: 3194-3199.

  20. Van Der Zanden AG, Te Koppele-Vize EM, Vijaya Bhanu N, Van Soolingen D, Schouls LM. Использование экстрактов ДНК из слайдов, окрашенных по Цилю-Нильсену, в результате молекулярного обнаружения устойчивости к рифампину и сполиготипирования Mycobacterium tuberculosis .J Clin Microbiol 2003; 41: 1101–1108.

  21. Pfyffer GE, Bonato DA, Ebrahimzadeh A, et al. Многоцентровая лабораторная валидация тестирования чувствительности Mycobacterium tuberculosis к классическим противомикробным препаратам второго ряда и более новых с использованием радиометрического метода BACTEC 460 и метода пропорций с твердой средой. J Clin Microbiol 1999; 37: 3179-3186.

  22. Lefford MJ, Mitchison DA.Сравнение методов тестирования чувствительности Mycobacterium tuberculosis к этионамиду. Tubercle 1966; 47: 250–262.

  23. Корейский институт туберкулеза, Корейская национальная туберкулезная ассоциация. Определение лекарственной чувствительности микобактерий пропорциональным методом. Отчет об исследовании, 1994 г.

  24. Митчисон Д.А. Что такое лекарственная устойчивость? Бугорок 1969; 50: 44–47.

  25. Kim SJ, Espinal MA, Abe C, et al. Надежен ли тест на чувствительность к противотуберкулезным препаратам второго ряда? Int J Tuberc Lung Dis 2004; 8: 1157–1158.

  26. Канетти Г. Лекция Дж. Бернса Амберсона: современные аспекты устойчивости бактерий при туберкулезе. Am Rev Respir Dis 1966; 92: 687–703.

  27. Иваински Х. Механизм действия, биотрансформация и фармакокинетика противотуберкулезных препаратов у животных и человека. In : Bartmann K, ed.Противотуберкулезные препараты. Нью-Йорк, Springer-Verlag, 1988; стр. 399–553

  28. Хейфец ЛБ. Восприимчивость к лекарствам при химиотерапии микобактериальных инфекций. Бока-Ратон, CRC Press, 1991

Прямое определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis для быстрого выявления множественной лекарственной устойчивости с использованием системы Bactec MGIT 960: многоцентровое исследование

РЕЗЮМЕ

Традиционное непрямое тестирование микобактерии туберкулеза на лекарственную чувствительность с использованием жидкой среды хорошо зарекомендовало себя и позволяет сэкономить время и надежные результаты.Это многоцентровое исследование было проведено для оценки возможности успешного проведения теста на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) непосредственно на обработанных образцах с положительным мазком (прямое ТЛЧ) и может ли этот подход обеспечить значительную экономию времени. Образцы мокроты переваривали, обеззараживали и концентрировали в соответствии с рутинной лабораторной процедурой и инокулировали в Bactec MGIT 960, а также в среду Левенштейна-Йенсена (LJ) для первичного выделения. Все обработанные образцы, которые дали положительный мазок на кислотоустойчивые бактерии (КУБ), были использованы для настройки прямого ТЛЧ к изониазиду (INH) и рифампицину (RIF).После добавления противомикробной смеси полимиксина B, амфотерицина B, налидиксовой кислоты, триметоприма и азлоциллина (PANTA) пробирки вводили в прибор MGIT 960, используя 21-дневный протокол (протокол пиразинамида Bactec 960 [PZA]). Результаты, полученные с помощью прямого ТЛЧ, сравнивались с результатами, полученными с помощью косвенного ТЛЧ, чтобы установить точность и экономию времени с помощью этого подхода. Из 360 образцов мокроты с положительным мазком на КУБ, подготовленных для прямого ТЛЧ в четырех центрах в трех разных странах, 307 (85%) образцов дали результаты, подлежащие регистрации.Среднее время отчетности для прямого перехода на летнее время составило 11 дней (диапазон от 10 до 12 дней). Средняя экономия времени с помощью прямого ТЛЧ по сравнению с непрямым ТЛЧ, которое включает время для выделения культуры и проведения ТЛЧ, составила 8 дней (диапазон от 6 до 9 дней). Когда результаты прямого ТЛЧ сравнивали с результатами непрямого ТЛЧ, было выявлено соответствие 95,1% с INH и 96,1% с рифампицином. Эти результаты показывают, что прямое ТЛЧ с помощью системы Bactec MGIT 960 обеспечивает дополнительную экономию времени и является быстрым методом надежного выявления случаев множественной лекарственной устойчивости (МЛУ).

ВВЕДЕНИЕ

По данным ВОЗ, лекарственная устойчивость туберкулеза (ТБ) является глобальной проблемой (30). Устойчивость к изониазиду (INH) и рифампицину (RIF), определяемая как множественная лекарственная устойчивость (MDR), растет во многих странах (3, 4, 31). Если эти случаи не лечить должным образом, у них может развиться устойчивость к другим лекарствам, таким как фторхинолоны и инъекционные аминогликозиды, определяемые как экстенсивная лекарственная устойчивость (ШЛУ), и могут, в свою очередь, инфицировать других лекарственно-устойчивым штаммом (5, 10 , 22).Для лучшего ведения случаев лекарственной устойчивости чрезвычайно важно раннее выявление устойчивости, чтобы можно было назначить эффективное лечение. Экспресс-тестирование лекарственной чувствительности играет важную роль в выявлении и борьбе с МЛУ / ШЛУ ТБ (23, 31).

Тесты на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) Mycobacterium tuberculosis обычно проводят после выделения культуры из клинического образца. Это занимает много времени, сначала для выделения культуры, а затем для проведения теста на лекарственную чувствительность (непрямое ТЛЧ).Если бы ТЛЧ можно было настроить одновременно с инокулированием обработанного образца в твердой или жидкой среде (прямое ТЛЧ), это могло бы значительно сэкономить время для обнаружения лекарственной устойчивости.

Прямое DST в обычной твердой среде хорошо зарекомендовало себя (9, 14, 15). Единственный недостаток — получение результатов на твердой среде занимает много времени, так как скорость роста на такой среде ниже. С введением жидкой среды Bactec 12B (Becton Dickinson Diagnostic Systems, Sparks, MD) время на сообщение результатов было значительно сокращено (13, 19, 24, 25).В 1993 г. CDC рекомендовал использовать жидкую среду на основании ее лучших характеристик и более ранних результатов (27). Прямое ТЛЧ с жидкой системой Bactec 460 было успешно опробовано (16). Однако использование радиометрического метода Bactec 460 постепенно прекращается из-за проблем, связанных с захоронением радиоактивных отходов. Эта система заменяется нерадиометрической системой Bactec MGIT 960 (Becton Dickinson Diagnostic Systems, Sparks, MD). Непрямая ТЛЧ хорошо известна в этой жидкой системе (1, 2, 6–8, 12, 20).В 2001 г. было опубликовано небольшое исследование с использованием ручной системы BBL MGIT по прямому ТЛЧ к INH и RIF с отличными результатами (11). В 2007 г. ВОЗ опубликовала политическое заявление с рекомендациями по использованию жидкой среды для стран с низким и средним уровнем доходов (32).

Это многоцентровое исследование было разработано, чтобы установить прямую выполнимость ТЛЧ в четырех различных клинических лабораториях с разными группами пациентов и параметрами теста. Основная цель этого исследования заключалась в создании стандартного протокола для прямого ТЛЧ с использованием автоматизированной системы Bactec MGIT 960.Результаты сравнивались с косвенными результатами ТЛЧ, чтобы установить точность, а также экономию времени при использовании этого подхода.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследовательские центры. Это исследование проводилось в четырех различных центрах в трех странах: (i) участок 1, P.D. Национальная больница и медицинский исследовательский центр Хиндуджа, больница третичного уровня, Мумбаи, Индия; (ii) участок 2, Институт туберкулеза и болезней легких LRS, специализированная противотуберкулезная больница и национальная справочная лаборатория (NRL), Нью-Дели, Индия; (iii) участок 3, больница Инда, благотворительная больница общего профиля, специализирующаяся на туберкулезе, особенно лечении МЛУ, Карачи, Пакистан; (iv) участок 4, Национальный справочный центр по микобактериям, национальный центр (с доступом к клиническим образцам из районов с высокой эндемичностью по МЛУ в других странах), Борстель, Германия.

Образцы. В это исследование были включены только образцы мокроты от пациентов с сильным подозрением на туберкулез, а также от пациентов с хроническими заболеваниями, особенно тех, у которых предполагается наличие МЛУ-ТБ. В исследование были включены образцы, которые оказались положительными по мазку на кислотоустойчивые бактерии (КУБ) независимо от степени положительного результата мазка. Образцы мокроты доставлялись в лабораторию с минимальной задержкой и охлаждались, если обработка не проводилась немедленно.

Обработка образцов.Все образцы были обработаны в соответствии со стандартным методом NALC-NaOH для разложения, обеззараживания и концентрирования (14, 26). Концентрированный осадок ресуспендировали примерно в 2-3 мл фосфатного буфера (pH 6,8) и тщательно перемешивали. Был приготовлен мазок для кислотостойкого окрашивания, и культуральные среды были засеяны в соответствии с лабораторной стандартной процедурой первичного выделения. Было обеспечено, чтобы для прямого ТЛЧ оставалось чуть более 1 мл суспензии.

Мазки AFB. Все мазки окрашивали методами Циля-Нильсена и / или флуорохромами.Мазки оценивали в соответствии с рекомендациями ВОЗ (28) и на основании количества КУБ, обнаруженных во время обследования. Мазки были оценены как скудные (от 1 до 9 AFB / 100 полей), 1+ (от 10 до 99/100 полей), 2+ (от 1 до 10 AFB / поле) или 3+ (более 10 AFB / поле). Две лаборатории не имели категории «скудные» в своей системе оценок (эти мазки были включены в категорию 1+).

Инокуляция питательной среды для первичной изоляции. Все четыре участка использовали систему Bactec MGIT 960 для жидкости, а для твердой среды использовали один наклон Левенштейна-Йенсена (LJ).Эти среды были засеяны в соответствии с установленной стандартной операционной процедурой (СОП) отдельной лаборатории. Для среды MGIT соблюдались стандартные рекомендуемые процедуры (рекомендации производителя и руководство MGIT от FIND [26]). После подготовки мазков и посевов для посева оставшуюся часть образца немедленно охлаждали до температуры от 2 ° C до 8 ° C и использовали для настройки прямого ТЛЧ, как только были получены результаты мазка.

Прямая процедура ТЛЧ. В процедуре прямого ТЛЧ было три основных отличия от стандартной непрямой процедуры ТЛЧ для MGIT 960: (i) прямое ТЛЧ было протоколом от 4 до 21 дня, а непрямое ТЛЧ — от 4 до 21 дня. 13-дневный протокол; (ii) контроль был разбавлен 1:10 при прямом ТЛЧ, тогда как при непрямом ТЛЧ он был разбавлен 1: 100; (iii) при прямом ТЛЧ к контролю добавляли противомикробную смесь полимиксина B, амфотерицина B, налидиксовой кислоты, триметоприма и азлоциллина (PANTA) (Becton Dickinson Diagnostic Systems, Sparks, MD), а также в лекарственное средство — содержащие пробирки MGIT для подавления загрязнения.

Все среды и другие реагенты были такими же, как те, что использовались в рутинной непрямой ТЛЧ: среда MGIT (7 мл пробирки MGIT со штрих-кодом), добавка SIRE для ТЛЧ и лиофилизированные препараты Bactec MGIT INH и RIF (Becton Dickinson Системы диагностики, Искры, МД).

Перед установкой прямого ТЛЧ лиофилизированный PANTA восстанавливали с использованием 15 мл добавки SIRE (не добавки для роста) (Becton Dickinson Diagnostic Systems, Sparks, MD) и хорошо перемешивали до полного растворения.Флаконы с лекарственными средствами (лиофилизированные препараты, такие же, как те, которые используются в MGIT непрямого ТЛЧ) с INH и RIF восстанавливали 4 мл стерильной деионизированной (DI) воды и хорошо перемешивали. Для каждого образца были подготовлены наборы из четырех пробирок MGIT для проведения прямого ТЛЧ. Две пробирки были помечены как «контроль роста» (GC), одна для INH, а другая для RIF. Третья пробирка была маркирована «INH», а четвертая — «RIF».

После растворения 0,8 мл смеси добавок PANTA-SIRE добавляли в каждую из четырех промаркированных пробирок MGIT.Следующим шагом было добавление лекарств. В пробирку с INH-меткой добавляли 0,1 мл восстановленного лиофилизированного лекарственного средства INH (конечная концентрация 0,1 мкг / мл). Аналогичным образом 0,1 мл восстановленного RIF добавляли в пробирку с меткой RIF (1,0 мкг / мл). Эти концентрации были такими же, как и при непрямой процедуре ТЛЧ (вкладыш в упаковке [26]). После перемешивания среды 0,5 мл хорошо перемешанного восстановленного осадка вносили в каждую из двух пробирок, содержащих лекарственное средство. Для контроля ресуспендированный осадок разбавляли 1:10 путем добавления 0.2 мл хорошо перемешанного осадка в 1,8 мл стерильного физиологического раствора или воды. После тщательного перемешивания в каждую из двух пробирок для ГХ вносили по 0,5 мл. Пробирки снова перемешивали, несколько раз переворачивая.

Для прямого перехода на летнее время использовался расширенный протокол, который обычно используется для непрямой настройки летнего времени PZA, поскольку прямое летнее время требует 21-дневного протокола для завершения теста (18, 26). Использовались два двухтрубных держателя набора DST. Пробирки с контролем роста и INH помещали в один набор носителей (GC и INH), а пробирки с контролем роста и RIF помещали в другой набор носителей (GC и RIF).Эти держатели набора были введены в прибор как тест PZA. Первой трубкой в ​​держателе набора всегда была контрольная.

На одном сайте применялся другой подход к работе с 21-дневным протоколом. Во втором варианте прямого перехода на летнее время процедуры были такими же, за исключением того, что использовался только один сборщик мусора. Пробирки для ГХ и INH помещали в один держатель с двумя пробирками и вводили как PZA DST. Пробирку RIF вводили как обычную пробирку для роста (42-дневный протокол) и помещали рядом с держателем набора INH.

Меры предосторожности. Все четыре объекта имеют хорошо оборудованные лаборатории BSL III. При обработке образцов, посевах и ТЛЧ соблюдались стандартные меры безопасности (29).

Интерпретация результатов прямого теста на лекарственную чувствительность. Когда ГХ достигал значения 400 единиц роста (GU) или более, прибор показывал, что тест завершен, набор чувствительности был удален после сканирования, и был распечатан отчет об инвентаризации. Результаты чувствительности для INH и RIF (в первом варианте) интерпретировались прибором как «S» или «R.В то время, когда значение GU GC составляло 400 или более, и если значение GU трубки с лекарством было меньше 100, результат теста сообщался как «чувствительный», тогда как если значение GU трубки с лекарством было 100 или Более того, результат был интерпретирован как «стойкий». Были получены и записаны значения GU обоих наборов DST. В случае, если значение GU для контроля не достигало 400 в течение 21 дня, прибор показывал ошибку X200, указывающую на недостаточный рост. С другой стороны, если GU достигло 400 раньше, чем на 4-й день, прибор выдает ошибку X400, указывая на контаминацию или чрезмерную инокуляцию.

Во втором варианте пробирки ГХ и INH извлекались, когда прибор показывал, что тест завершен и результаты получены. Были получены значения GU набора INH. Поскольку пробирка RIF инкубировалась в системе отдельно как обычная пробирка для роста, прибор не интерпретировал результаты. На этом этапе значение GU трубки RIF также было получено путем распечатки отчета об инвентаризации прибора. Результаты были интерпретированы вручную в соответствии с указанными выше критериями.

Для расчета времени, необходимого для получения прямых результатов DST, было записано время, которое потребовалось прибору для завершения теста DST. Поскольку прибор показывает время в часах, любое время, равное половине дня или более, принималось за полный день.

Эталонный метод: непрямое тестирование лекарственной чувствительности. Прослеживали пробирки для первичного выделения образцов, включенных в исследование. После того, как инокулированный образец оказался положительным по культуре в MGIT и подтвердил наличие чистой культуры M.tuberculosis, непрямое ТЛЧ было установлено в соответствии с процедурами, рекомендованными производителем для системы MGIT 960. Результаты непрямого ТЛЧ и время, необходимое для завершения теста, извлекались из прибора и записывались.

Для расчета времени, необходимого для отражения в отчетности косвенных результатов ТЛЧ для образца, для получения общего времени было добавлено время получения положительной культуры плюс время получения косвенных результатов ТЛЧ. Поскольку косвенное летнее время устанавливается через 1–5 дней после того, как прибор дает положительный сигнал, к общему времени было добавлено дополнительно 2 дня.Иногда ТЛЧ не устанавливали в течение 5 дней после получения положительного результата посева в MGIT, и требовалось субкультивирование. На этот раз документально не зафиксировано. Время, необходимое для непрямого ТЛЧ, сравнивали со временем, требуемым для прямого ТЛЧ того же образца. Разница считалась экономией времени.

На участке 4 рутинное непрямое ТЛЧ также проводилось на среде LJ, но результаты не были включены в этот анализ.

Идентификация выделенных микобактерий. Метод MGIT 960 ТЛЧ рекомендуется для M.tuberculosis, и поэтому выделенные микобактерии из образцов с положительной культурой были идентифицированы с использованием стандартного метода, используемого в лабораториях для идентификации M. tuberculosis. В это исследование были включены только те культуры, которые подтверждены как M. tuberculosis. Прямые результаты ТЛЧ для тех образцов, которые были заражены или у которых была микобактерия, отличная от M. tuberculosis, были исключены.

Тестирование несоответствия. Образцы, показавшие несовпадающие результаты между прямым и косвенным методами, были повторно протестированы путем повторения косвенного метода.Если результаты второго тестирования были такими же, как и первые косвенные результаты, результаты прямой восприимчивости считались несоответствующими. Если результаты повторного тестирования не соответствовали предыдущим косвенным результатам и соответствовали прямым результатам, то результаты считались правильными.

Контроль качества М. tuberculosis h47Rv (ATCC 27294) использовали для тестирования качества (QC) при ТЛЧ. Этот штамм вводили каждый раз, когда устанавливали партию ТЛЧ, или как каждый 6-й изолят в прогоне.Если наблюдалась какая-либо устойчивость в штамме QC, все остальные результаты в этой партии считались недействительными.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Из 360 обработанных образцов 307 (85%) результатов ТЛЧ подлежали регистрации (Таблица 1). Большинство из тех, о которых не сообщалось, были те, в которых контроль не достиг необходимого порога (ошибка X200), в то время как некоторые были загрязнены (ошибка X400). На участке 1 обработано 126 образцов мокроты и получено 113 результатов (90%), на участке 2 обработано 122 образца и получено 103 результата (84%), на участке 3 обработано 74 образца и получено 58 результатов (84%), а на участке 4 — 33 результата, подлежащих регистрации. из 38 обработанных образцов (87%).Образцы, которые были отрицательными для посева, были загрязнены или имели нетуберкулезные микобактерии (NTM), были исключены для расчета результатов, подлежащих регистрации. Всего было 15 образцов, которые имели контаминацию, 8 были идентифицированы как NTM, 19 имели ошибку X200 и 5 имели ошибку X400.

Таблица 1

Общая информация об испытаниях

Время для сообщения результатов положительных культур было проанализировано в соответствии со степенью положительности мазка на КУБ (Таблица 2). Большинство образцов были 2–3+ положительными мазками на всех участках.Время до обнаружения положительного результата посева существенно не различается для разных классов мазков. В целом, посевы были положительными в среднем через 8 дней с диапазоном от 8 до 10 дней.

Таблица 2

Время обнаружения MGIT-положительных культур

Время до завершения прямого ТЛЧ обработанных образцов рассчитывалось в соответствии с категориями положительных мазков (таблица 3). Не было значительной разницы между временем получения прямых результатов ТЛЧ в разных категориях с положительным мазком.Большинство результатов было готово в течение 8–14 дней, при этом в среднем 10 дней на участке 1, 11 дней на участках 2 и 3 и 12 дней на участке 4.

Таблица 3

Время сообщить результаты прямой лекарственной чувствительности от обработанные образцы

В таблице 4 указано среднее время завершения непрямого ТЛЧ от изолированных культур без учета времени до положительного результата посева. Среднее время для сообщения о непрямом ТЛЧ от изолированной культуры варьировалось от 6 дней (сайт 4) до 10 дней (сайт 2).

Таблица 4

Время представить результаты испытаний на непрямую чувствительность из изолированных культур a

Общее время, необходимое с момента обработки образца до момента получения косвенных результатов ТЛЧ, включено в Таблицу 6. Он составлял от 18 до 20 дней.

Противоречивые результаты были проанализированы по всем прямым тестам на ТЛЧ, по которым были доступны подтвержденные косвенные результаты ТЛЧ (таблица 5). Из 113 образцов, представленных сайтом 1, 5 образцов показали противоречивые результаты прямого и косвенного методов определения изониазида (4.4%): три результата были отмечены как ложноустойчивые, а два результата — как ложно восприимчивые. Для RIF было три несоответствующих результата (2,7%), два из которых были ложно восприимчивыми, а один — ложно устойчивым к RIF. На участке 2 из 103 образцов три показали противоречивые результаты по INH (2,9%), причем все они были ложно чувствительными. Также для RIF было всего три несоответствующих результата (2,9%): два ложно-устойчивых и один ложно-восприимчивый. В сайте 3 из 58 тестов на INH (10,3%) были получены противоречивые результаты, четыре из которых были ложно-устойчивыми, а два — ложно-чувствительными.Для RIF было пять несовпадающих результатов (8,6%), два из которых были ложно-устойчивыми, а три — ложно-чувствительными. В центре 4 из 33 тестов была только одна (3,0%) ложная устойчивость к INH и одна (3,0%) ложная чувствительность к RIF. Таким образом, общее расхождение результатов для INH и 3,9% для RIF по всем сайтам составило 4,9%.

Таблица 5

Несоответствующие результаты между прямым и косвенным методами ТЛЧ

Результаты экономии времени с помощью прямого ТЛЧ приведены в Таблице 6. Общая экономия времени составила 8 дней, в диапазоне от 6 до 9 дней на всех участках.

Таблица 6

Экономия времени за счет тестирования прямой чувствительности обработанных образцов

Для контроля качества был настроен h47Rv вместе с партиями прямого и непрямого ТЛЧ. Ни в одном учреждении не было ни одного случая, когда h47 Rv не давал ожидаемых результатов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты, полученные с помощью обычных методов непрямого тестирования чувствительности, особенно с твердыми средами, становятся доступными слишком поздно, чтобы повлиять на своевременное решение о ведении пациентов.Следовательно, необходимы более быстрые тесты на чувствительность к туберкулезу, непосредственно применяемые к клиническим образцам. Некоторые из некоммерчески доступных прямых тестов включают анализ нитратредуктазы (NRA) и анализ чувствительности к лекарствам под микроскопом (MODS). Эти тесты были разработаны как «внутренние» анализы с целью преодоления высокой стоимости коммерчески доступных методов. В NRA добавление реагента NRA требует регулярного открытия пробирок, что создает значительный риск образования аэрозолей.Чтение планшетов MODS необходимо выполнять ежедневно, это трудоемко и требует много времени (34). Коммерчески доступные молекулярные анализы, такие как Genotype MTBDR Plus (Hain Lifescience, Nehren, Германия), можно применять непосредственно к образцам с положительным мазком, и они требуют меньше времени на обработку, что позволяет сэкономить несколько недель. Однако ни один из установленных молекулярных тестов не нацелен на все возможные гены, участвующие в устойчивости, и, таким образом, различная доля устойчивых штаммов может не быть обнаружена (17, 33).Жидкая культура признана золотым стандартом и является наиболее быстрой для фенотипической ТЛЧ. Это исследование было направлено на установление экономии времени при использовании прямого подхода к ТЛЧ по сравнению с обычным непрямым подходом в жидкой среде, поэтому молекулярное тестирование не было включено в исследование.

Жидкая культура предлагает более чувствительный и быстрый метод выделения M. tuberculosis и проведения тестов на чувствительность к различным противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда (13, 21).Однако большинство исследований ТЛЧ проводилось обычным непрямым методом с использованием изолированных культур. Это первое крупномасштабное многоцентровое исследование по оценке прямой чувствительности к M. tuberculosis на клинических образцах с использованием автоматизированной системы жидких культур MGIT 960.

Поскольку туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью является одной из основных проблем в программе борьбы с туберкулезом, а результаты ТЛЧ играют важную роль в борьбе с туберкулезом, мы сосредоточились на прямом ТЛЧ только к двум препаратам: изониазиду и рифу.Это не означает, что этот подход применим только к этим двум противомикробным препаратам. Ожидается, что это исследование может стать руководством для быстрого прямого ТЛЧ на основе бульонов к другим противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда, что особенно поможет, если у пациента есть подозрение на устойчивость к этим препаратам.

Одной из основных проблем было выполнение прямого перехода на летнее время. Ранее было установлено, что для прямого ТЛЧ с использованием жидкой среды продолжительность протокола испытаний должна быть увеличена с 14 до 21 дня, поскольку M.tuberculosis, присутствующий в клиническом образце, не растет так быстро, как в изолированной культуре (16). В предлагаемом протоколе прямое ТЛЧ проводится для образца с положительным мазком AFB с любой степенью положительного результата мазка при любой процедуре окрашивания; таким образом, в некоторых случаях количество бактерий, присутствующих в посевном материале, невелико, и для достижения необходимого уровня роста или GU может потребоваться более 14 дней. Процедура непрямого ТЛЧ MGIT 960 разработана с протоколом от 4 до 13 дней, за исключением ТЛЧ PZA, которое представляет собой тест от 4 до 21 дня.Однако тест PZA разработан только для двухтрубной системы. Мы попробовали несколько различных подходов к рабочему процессу, чтобы добиться результатов с 21-дневным протоколом. Первый подход заключался в том, чтобы установить для каждого препарата свой собственный контроль, а затем ввести его в прибор в двухпробирном держателе набора в качестве теста PZA. Это простая, понятная и предпочтительная процедура, и прибор автоматически интерпретирует результаты. Однако некоторые исследователи считали этот подход дорогостоящим, поскольку для каждого препарата необходим контроль, что означает необходимость в большем количестве пробирок MGIT.Чтобы снизить стоимость, мы придумали другой подход, при котором первое лекарство, в данном случае контроль роста и INH, вводится в прибор с протоколом PZA. Другая пробирка с лекарством, а именно RIF, вводится в прибор как пробирка для роста, а не пробирка DST. Пробирка помещается в тот же ящик рядом с пробирками INH DST. Когда набор INH готов (GU контроля достигает 400 или более), прибор отмечает его как завершенный и интерпретирует результаты как «S» или «R.» В это время значения GU для пробирки RIF извлекаются путем запроса инвентарных значений GU для инкубируемых пробирок в приборе, а затем записывается значение GU для пробирки RIF.Это делается путем печати отчета об инвентаризации без сканирования трубки из прибора перед печатью, поскольку значения GU могут быть потеряны. В случае, если сложно разместить одну пробирку в выдвижном ящике, есть еще одна возможность поместить эту пробирку RIF в держатель для двух пробирок DST, поместив сначала пустую пробирку со средой MGIT в качестве контроля роста, а затем пробирку RIF. Этот установленный носитель вводится в прибор как PZA DST и помещается рядом с установленным INH. Поскольку управление не инокулируется, эта установленная несущая должна быть извлечена одновременно с установленной несущей INH.Значения GU извлекаются и записываются перед сканированием этого второго набора носителей; в противном случае значения GU будут потеряны. Интерпретация RIF DST выполняется вручную на основе формулы, приведенной в предыдущем разделе. Незасеянную пробирку для контроля роста можно использовать снова и снова. Вышеописанная процедура может применяться для любого и любого количества лекарств, которое необходимо.

Это исследование проводилось в хорошо зарекомендовавших себя лабораториях. Показатель положительного результата посева образцов с положительным мазком был очень высоким (более 95%), с приемлемыми показателями контаминации (от 4 до 8%) и очень низкой распространенностью НТМ.Общий показатель успешности ТЛЧ к препаратам с положительным мазком составил 85%. Это означает, что только от 10 до 15% от общего числа настроек DST было невозможно интерпретировать из-за нескольких причин, таких как загрязнение или наличие NTM (ошибки X400) или отсутствие роста или недостаточный рост в контроле (ошибки X200). Некоторые из них, несмотря на положительный результат мазка на КУБ (даже 3+), либо не вырастали в пробирке для первичной изоляции и были отрицательными на культуре, либо роста было недостаточно для интерпретации прямых результатов ТЛЧ (ошибка X200). Информация об успешности прямого DST важна для оценки рентабельности прямого DST.

Наиболее важным аспектом наших выводов является экономия времени за счет прямого перехода на летнее время. Время для сообщения о непрямом ТЛЧ Bactec MGIT от положительных культур варьировалось от 6 до 10 дней, что согласуется со многими более ранними сообщениями (1, 2, 7, 20). Это время для отчета варьируется в зависимости от многих факторов, включая изменчивость стандартной процедуры, выполняемой в лаборатории, популяцию пациентов и распространенность лекарственной устойчивости. Известно, что изолятам, устойчивым к лекарствам, обычно требуется больше времени для роста, чем изолятам, чувствительным к лекарствам.Общее время для отчета о непрямом ТЛЧ рассчитывалось как время, необходимое для выделения культуры, время, необходимое для настройки ТЛЧ, и время, необходимое для получения результатов теста на чувствительность от положительной культуры. С другой стороны, время сообщить о прямом ТЛЧ было временем для достижения результатов ТЛЧ после инокуляции обработанного образца. Экономия времени за счет прямого перехода на летнее время составила в целом 8 дней и не сильно варьировалась от сайта к сайту. Эта экономия времени очень важна, так как в случае МЛУ на счету каждый день.Результаты показывают, что прямое ТЛЧ дополнительно сокращает время, необходимое для сообщения результатов о чувствительности. После прямого ТЛЧ в среднем сайты 1 и 4 сообщали о прямых результатах ТЛЧ через 2 дня положительных результатов посева, а сайты 2 и 3 сообщали после трех дней положительных результатов посева. Эти сайты обрабатывают большое количество случаев МЛУ, и, таким образом, среди всех изученных нами случаев хорошо представлены случаи лекарственной устойчивости.

Другой целью данного исследования была оценка точности результатов, полученных прямым методом.В этом расчете косвенное ТЛЧ считалось золотым стандартом, и в случае противоречивых результатов непрямое ТЛЧ было повторено. В целом, среди четырех сайтов только 4,9% результатов были противоречивыми в случае INH и 3,9% в случае RIF, с 2,3% ложной чувствительностью (очень большая ошибка) для INH и 2,5% для рифампицина. Ложная резистентность (основная ошибка) составила 2,6% для INH и 1,6% для рифампицина. На одном сайте разногласия были выше, чем на трех других. Не было четкой картины противоречивых результатов, поскольку при использовании INH и RIF наблюдались как ложная резистентность, так и ложная восприимчивость.

Таким образом, в этом многоцентровом исследовании был установлен стандартный протокол для определения прямой чувствительности с помощью автоматизированной системы Bactec MGIT. О результатах ТЛЧ можно сообщить через 2–3 дня после получения положительных результатов посева. Такая значительная экономия времени может оказать большую помощь в назначении эффективного лечения, особенно в случаях МЛУ. Если стоимость вызывает беспокойство, а распространенность монорезистентности к RIF не является обычным явлением, только RIF может быть протестирован и может считаться суррогатным маркером для MDR.Прямое ТЛЧ является надежным тестом, поскольку результаты, полученные с помощью прямого ТЛЧ, на 95–96% совпадают с результатами, полученными косвенным методом.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Кирстен Отт (Национальный справочный центр по микобактериям, Борстель, Германия) за ценный вклад в это исследование. Мы благодарим Becton Dickinson за предоставленные реагенты.

Салман Сиддики имеет консалтинговое соглашение с BD и рядом других организаций, занимающихся диагностикой ТБ. Остальные авторы не сообщают о конфликте интересов.

СНОСКИ

    • Получено 29 сентября 2011 г.
    • Возвращено для модификации 26 октября 2011 г.
    • Принято 29 ноября 2011 г.
    • Принято рукопись размещена в Интернете 7 декабря 2011 г.
  • Copyright © 2012, American Society Микробиология. Все права защищены.

ССЫЛКИ

  1. 1.↵
  2. 2.↵
  3. 3.↵
  4. 4.↵
  5. 5.↵
  6. 6.↵
  7. 7.↵
  8. 8.↵
  9. 9.↵

    CLSI. 2007. Тестирование чувствительности микобактерий, нокардий и аэробных актиномицетов: утвержденные стандарты, второе издание, том 26, № 23. Документ CLSI M24-2. Институт клинических и лабораторных стандартов, Уэйн, Пенсильвания.

  10. 10.↵
  11. 11.↵
  12. 12.↵
  13. 13.↵
  14. 14.↵
  15. 15.↵
  16. 16.↵
  17. 17.↵
  18. 18.↵
  19. 19 .↵
  20. 20.↵
  21. 21.↵
  22. 22.↵
  23. 23.↵
  24. 24.↵
  25. 25.↵
  26. 26.↵
  27. 27.↵
  28. 28.↵

    Всемирная организация здравоохранения. 1998. Лабораторная серия по борьбе с туберкулезом. Часть II, микроскопия. WHO / TB / 98.258. Всемирная организация здравоохранения, Женева, Швейцария.

  29. 29.↵

    Всемирная организация здравоохранения. 2004. Руководство по биобезопасности в лабораториях, 3-е изд. WHO / CDS / CSR / LYO / 2004.11. Всемирная организация здравоохранения, Женева, Швейцария.

  30. 30.↵

    Всемирная организация здравоохранения.2004. Противотуберкулезная лекарственная устойчивость в мире. № отчета 3. Глобальный проект ВОЗ / IUATLD по надзору за лекарственной устойчивостью к туберкулезу. WHO / HTM / TB / 2004. 343. Всемирная организация здравоохранения, Женева, Швейцария.

  31. 31.↵

    Всемирная организация здравоохранения. 2006. Руководство по программному лечению туберкулеза с лекарственной устойчивостью. WHO / HTM / TB / 2006.361. Всемирная организация здравоохранения, Женева, Швейцария.

  32. 32.↵

    Всемирная организация здравоохранения.2007. Использование жидкой культуры туберкулеза и тестов на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) в странах с низким и средним уровнем дохода. Сводный отчет заседания экспертной группы по использованию жидких питательных сред. Всемирная организация здравоохранения, Женева, Швейцария.

  33. 33.↵

    Всемирная организация здравоохранения. 2008. Заявление о политике. Зондовые молекулярные тесты для быстрого скрининга пациентов с риском туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ). Всемирная организация здравоохранения, Женева, Швейцария.

  34. 34.↵

    Всемирная организация здравоохранения. 2010. Заявление о политике. Некоммерческое культивирование и тестирование лекарственной чувствительности для быстрого скрининга пациентов с риском МЛУ-ТБ. Всемирная организация здравоохранения, Женева, Швейцария.

Руководство для исследований по оценке точности экспресс-тестов на лекарственную чувствительность от туберкулеза | Журнал инфекционных болезней

Аннотация

Разработка и внедрение экспресс-молекулярной диагностики для определения лекарственной чувствительности туберкулеза (ТБ) имеет решающее значение для информирования пациентов о лечении и предотвращения появления и распространения резистентности.Оптимальное планирование испытаний существующих и разрабатываемых тестов будет иметь решающее значение для быстрого сбора доказательств, необходимых для информирования Всемирной организации здравоохранения и поддержки потенциальных рекомендаций по политике. Необходимые доказательства включают оценку эффективности обнаружения туберкулеза и устойчивости, а также оценку рабочих характеристик этих платформ. Оценка эффективности должна включать аналитические исследования для подтверждения предела обнаружения и возможности анализа для выявления мутаций, придающих устойчивость у глобально репрезентативных штаммов.Аналитическая оценка обычно сопровождается клиническими оценочными исследованиями на нескольких участках для подтверждения диагностической эффективности в местах и ​​группах предполагаемого использования. В этой статье кратко изложены соображения по поводу дизайна этих аналитических и клинических исследований.

Быстрая и точная диагностика туберкулеза (ТБ) и определение лекарственной чувствительности имеют решающее значение для лечения пациентов и предотвращения появления и распространения устойчивых штаммов. Во всем мире в 2017 году менее одной трети новых больных ТБ прошли тестирование на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) к рифампицину (RIF), одному из наиболее важных препаратов первого ряда [1].Это приводит к недостаточному лечению лекарственно-устойчивого ТБ (ЛУ-ТБ), дальнейшему усилению и передаче устойчивости и связанной с этим смертности [2]. Смоделированные данные предсказывают рост заболеваемости ТБ с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) с увеличением на 9–33% только на Филиппинах, в Индии и в России [3, 4]. В 2017 г. только 50% из тех, у кого в 2017 г. был диагностирован туберкулез с устойчивостью к РИФ, прошли ТЛЧ второго ряда, даже при подозрении на МЛУ-ТБ [1]. Отсутствие информации о чувствительности к препаратам второго ряда, особенно к приоритетным соединениям профиля целевого продукта (TPP), таким как фторхинолоны (FQ) [5], может привести к катастрофическим последствиям для пациентов, увеличению нагрузки на системы здравоохранения. и передача устойчивого туберкулеза.Без решения этих ключевых вопросов цель в области устойчивого развития на период до 2030 года по прекращению эпидемии туберкулеза не будет достигнута.

Ввиду ограниченности традиционных фенотипических методов, разработка быстрой молекулярной диагностики ТЛЧ к туберкулезу стала приоритетом исследований и разработок [6]. Хотя развертывание и внедрение новых средств диагностики ЛУ-ТБ, таких как анализ Xpert MTB / RIF (Cepheid, Саннивейл, Калифорния), увеличило количество выявленных и зарегистрированных случаев ТБ и ЛУ-ТБ [1, 7], важная диагностика и лечение остаются пробелы.В частности, существует острая потребность в быстрых молекулярных ТЛЧ, которые выявляют устойчивость к более широкому набору лекарственных соединений, в том числе к тем, которые приоритетны в TPP [5]. Несколько новых анализов были разработаны в соответствии с существующим TPP [5], и некоторые из них уже продемонстрировали многообещающую эффективность для комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTBC) и выявления лекарственной устойчивости в ранних исследованиях [8–13]. Однако исследования этих технологий редко дают адекватную информацию для обзора Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и поддерживают потенциальные политические рекомендации.Например, эти исследования (1) часто не включают хорошо охарактеризованные сравнительные анализы, (2) не проверяют адекватный выбор мутаций устойчивости у штаммов с широким географическим разнообразием, (3) не включают адекватный размер выборки для достижения точности диагностики. целевых показателей или (4) использовать поток выборки, который не позволяет проводить надежные сравнения между индексным тестом, эталонным тестом и компараторами.

В этой статье мы определяем стандарты сбора доказательств для решений ТЛЧ к туберкулезу, чтобы гарантировать, что аналитические и клинические оценки дают ответы на ключевые вопросы, позволяющие провести всесторонний обзор технологий.Мы суммируем наши рекомендации в Таблице 1.

Таблица 1.

Обзор рекомендаций по дизайну исследования

Тема . Рекомендация .
Индекс-тест • Определите, является ли тест рефлекторным тестом на ТБ-положительный результат или же тест выявляет MTBC в дополнение к сопротивлению при разработке исследований
• Учитывайте особенности индексного теста исследуются (например, пропускная способность, поливалентность, взаимосвязь) в дизайне исследования
Общие соображения по дизайну исследования • Первоначальные лабораторные аналитические исследования должны подтвердить точность анализа для MTBC и обнаружения устойчивости (может быть охвачен более широкий диапазон мутаций, чем в клиническое исследование)
• Производители должны предоставлять данные об инклюзивности и исключительности анализа, желательны данные об обнаружении резистентности в гетерорезистентных образцах
• Клинические оценочные исследования должны оценивать диагностическую эффективность ТБ тесты на лекарственную чувствительность в образцах пациентов в условиях предполагаемого использования
Население и условия • В идеале следует выбрать не менее 3 участков из 3 различных регионов ВОЗ, которые отражают эпидемию ТБ и ЛУ-ТБ в странах с высоким бременем
• Проведите тестирование в предполагаемых условиях использования (например, в справочных лабораториях центрального уровня для высокопроизводительных тестов и в центрах первичной медико-санитарной помощи для тестов с низкой пропускной способностью или одноразовых тестов)
• Должны быть установлены целевые показатели размера выборки с учетом определенных TPP целевых оценок эффективности для каждого лекарственного средства, к которому, по утверждениям анализа, выявляется устойчивость.В идеале ширина доверительных интервалов должна составлять ≤5% для оценок специфичности и ≤10% для оценок чувствительности.
Эталонный стандарт и компараторы • Учитывая потребность в полной картине лекарственной устойчивости и устранении несоответствий, рекомендуется использовать составной эталонный стандарт, который объединяет информацию о генотипическом секвенировании и результаты тестирования фенотипической чувствительности
• Включать тесты, одобренные ВОЗ (например, одобренные ВОЗ линейные зонды и тесты Xpert MTB / RIF или Ultra) в качестве компараторов как в аналитических, так и в клинических исследованиях
Проблемы с потоком и образцом • В идеале индексные, контрольные и сравнительные тесты должны выполняться на одном и том же образце, чтобы обеспечить сопоставимость результатов
• В качестве альтернативы, для тестов на основе мокроты индексный тест может быть выполнен дважды: один раз для прямого образца мокроты и один раз на культивированном изоляте вместе с контрольными тестами и тестами сравнения
Ключевые слова: иски, превышающие точность • Различные технические и операционные параметры анализа, которые следует оценивать, включают время получения результата, недействительные и неопределенные показатели и другие факторы (Таблица 2)
Тема . Рекомендация .
Индекс-тест • Определите, является ли тест рефлекторным тестом на ТБ-положительный результат или же тест выявляет MTBC в дополнение к сопротивлению при разработке исследований
• Учитывайте особенности индексного теста исследуются (например, пропускная способность, поливалентность, взаимосвязь) в дизайне исследования
Общие соображения по дизайну исследования • Первоначальные лабораторные аналитические исследования должны подтвердить точность анализа для MTBC и обнаружения устойчивости (может быть охвачен более широкий диапазон мутаций, чем в клиническое исследование)
• Производители должны предоставлять данные об инклюзивности и исключительности анализа, желательны данные об обнаружении резистентности в гетерорезистентных образцах
• Клинические оценочные исследования должны оценивать диагностическую эффективность ТБ тесты на лекарственную чувствительность в образцах пациентов в условиях предполагаемого использования
Население и условия • В идеале следует выбрать не менее 3 участков из 3 различных регионов ВОЗ, которые отражают эпидемию ТБ и ЛУ-ТБ в странах с высоким бременем
• Проведите тестирование в предполагаемых условиях использования (например, в справочных лабораториях центрального уровня для высокопроизводительных тестов и в центрах первичной медико-санитарной помощи для тестов с низкой пропускной способностью или одноразовых тестов)
• Должны быть установлены целевые показатели размера выборки с учетом определенных TPP целевых оценок эффективности для каждого лекарственного средства, к которому, по утверждениям анализа, выявляется устойчивость.В идеале ширина доверительных интервалов должна составлять ≤5% для оценок специфичности и ≤10% для оценок чувствительности.
Эталонный стандарт и компараторы • Учитывая потребность в полной картине лекарственной устойчивости и устранении несоответствий, рекомендуется использовать составной эталонный стандарт, который объединяет информацию о генотипическом секвенировании и результаты тестирования фенотипической чувствительности
• Включать тесты, одобренные ВОЗ (например, одобренные ВОЗ линейные зонды и тесты Xpert MTB / RIF или Ultra) в качестве компараторов как в аналитических, так и в клинических исследованиях
Проблемы с потоком и образцом • В идеале индексные, контрольные и сравнительные тесты должны выполняться на одном и том же образце, чтобы обеспечить сопоставимость результатов
• В качестве альтернативы, для тестов на основе мокроты индексный тест может быть выполнен дважды: один раз для прямого образца мокроты и один раз на культивированном изоляте вместе с контрольными тестами и тестами сравнения
Ключевые слова: иски за пределами точности • Различные технические и операционные параметры анализа, которые необходимо оценить, включают время получения результата, недействительные и неопределенные показатели и другие факторы (Таблица 2)
Таблица 1.

Обзор рекомендаций по дизайну исследования

Тема . Рекомендация .
Индекс-тест • Определите, является ли тест рефлекторным тестом на ТБ-положительный результат или же тест выявляет MTBC в дополнение к сопротивлению при разработке исследований
• Учитывайте особенности индексного теста исследуются (например, пропускная способность, поливалентность, взаимосвязь) в дизайне исследования
Общие соображения по дизайну исследования • Первоначальные лабораторные аналитические исследования должны подтвердить точность анализа для MTBC и обнаружения устойчивости (может быть охвачен более широкий диапазон мутаций, чем в клиническое исследование)
• Производители должны предоставлять данные об инклюзивности и исключительности анализа, желательны данные об обнаружении резистентности в гетерорезистентных образцах
• Клинические оценочные исследования должны оценивать диагностическую эффективность ТБ тесты на лекарственную чувствительность в образцах пациентов в условиях предполагаемого использования
Население и условия • В идеале следует выбрать не менее 3 участков из 3 различных регионов ВОЗ, которые отражают эпидемию ТБ и ЛУ-ТБ в странах с высоким бременем
• Проведите тестирование в предполагаемых условиях использования (например, в справочных лабораториях центрального уровня для высокопроизводительных тестов и в центрах первичной медико-санитарной помощи для тестов с низкой пропускной способностью или одноразовых тестов)
• Должны быть установлены целевые показатели размера выборки с учетом определенных TPP целевых оценок эффективности для каждого лекарственного средства, к которому, по утверждениям анализа, выявляется устойчивость.В идеале ширина доверительных интервалов должна составлять ≤5% для оценок специфичности и ≤10% для оценок чувствительности.
Эталонный стандарт и компараторы • Учитывая потребность в полной картине лекарственной устойчивости и устранении несоответствий, рекомендуется использовать составной эталонный стандарт, который объединяет информацию о генотипическом секвенировании и результаты тестирования фенотипической чувствительности
• Включать тесты, одобренные ВОЗ (например, одобренные ВОЗ линейные зонды и тесты Xpert MTB / RIF или Ultra) в качестве компараторов как в аналитических, так и в клинических исследованиях
Проблемы с потоком и образцом • В идеале индексные, контрольные и сравнительные тесты должны выполняться на одном и том же образце, чтобы обеспечить сопоставимость результатов
• В качестве альтернативы, для тестов на основе мокроты индексный тест может быть выполнен дважды: один раз для прямого образца мокроты и один раз на культивированном изоляте вместе с контрольными тестами и тестами сравнения
Ключевые слова: иски, превышающие точность • Различные технические и операционные параметры анализа, которые следует оценивать, включают время получения результата, недействительные и неопределенные показатели и другие факторы (Таблица 2)
Тема . Рекомендация .
Индекс-тест • Определите, является ли тест рефлекторным тестом на ТБ-положительный результат или же тест выявляет MTBC в дополнение к сопротивлению при разработке исследований
• Учитывайте особенности индексного теста исследуются (например, пропускная способность, поливалентность, взаимосвязь) в дизайне исследования
Общие соображения по дизайну исследования • Первоначальные лабораторные аналитические исследования должны подтвердить точность анализа для MTBC и обнаружения устойчивости (может быть охвачен более широкий диапазон мутаций, чем в клиническое исследование)
• Производители должны предоставлять данные об инклюзивности и исключительности анализа, желательны данные об обнаружении резистентности в гетерорезистентных образцах
• Клинические оценочные исследования должны оценивать диагностическую эффективность ТБ тесты на лекарственную чувствительность в образцах пациентов в условиях предполагаемого использования
Население и условия • В идеале следует выбрать не менее 3 участков из 3 различных регионов ВОЗ, которые отражают эпидемию ТБ и ЛУ-ТБ в странах с высоким бременем
• Проведите тестирование в предполагаемых условиях использования (например, в справочных лабораториях центрального уровня для высокопроизводительных тестов и в центрах первичной медико-санитарной помощи для тестов с низкой пропускной способностью или одноразовых тестов)
• Должны быть установлены целевые показатели размера выборки с учетом определенных TPP целевых оценок эффективности для каждого лекарственного средства, к которому, по утверждениям анализа, выявляется устойчивость.В идеале ширина доверительных интервалов должна составлять ≤5% для оценок специфичности и ≤10% для оценок чувствительности.
Эталонный стандарт и компараторы • Учитывая потребность в полной картине лекарственной устойчивости и устранении несоответствий, рекомендуется использовать составной эталонный стандарт, который объединяет информацию о генотипическом секвенировании и результаты тестирования фенотипической чувствительности
• Включать тесты, одобренные ВОЗ (например, одобренные ВОЗ линейные зонды и тесты Xpert MTB / RIF или Ultra) в качестве компараторов как в аналитических, так и в клинических исследованиях
Проблемы с потоком и образцом • В идеале индексные, контрольные и сравнительные тесты должны выполняться на одном и том же образце, чтобы обеспечить сопоставимость результатов
• В качестве альтернативы, для тестов на основе мокроты индексный тест может быть выполнен дважды: один раз для прямого образца мокроты и один раз на культивированном изоляте вместе с контрольными тестами и тестами сравнения
Ключевые слова: иски, превышающие точность • Различные технические и операционные параметры анализа, которые должны быть оценены, включают время получения результата, недействительные и неопределенные показатели и другие факторы (Таблица 2) ТРУБОПРОВОД ДЛЯ ИСПЫТАНИЯ НА УСТОЙЧИВОСТЬ

Тесты на ТЛЧ к туберкулезу предназначены для выявления устойчивости к противотуберкулезным препаратам непосредственно из клинических образцов.Эти анализы могут использоваться как предварительный тест и включать обнаружение MTBC или только как рефлексный тест на положительный результат анализов обнаружения MTBC. Анализы ТЛЧ с высокой пропускной способностью обычно используются в центральных референс-лабораториях, включая специализированные лаборатории 3-го уровня или районные больницы 2-го уровня, тогда как тесты на ТЛЧ с меньшей производительностью могут быть реализованы в центрах уровня-1.

Несколько недавно разработанных анализов, которые в настоящее время находятся на пути к одобрению ВОЗ и нацелены на использование в централизованных лабораториях, включают анализы Abbott RealTi m e MTB и MTB RIF / INH (Abbott, North Chicago, IL), Roche COBAS MTB и Анализ MTB-RIF / INH (Roche Diagnostics, Базель, Швейцария), анализ Hain FluoroType MTBDR (Hain Lifescience GmbH, Нерен, Германия) и анализ BD MAX MDR-TB (Becton Dickinson, Франклин Лейкс, Нью-Джерси) [8– 11].Тест Abbott RealTi m e MTB может диагностировать MTBC в 94 образцах, при этом положительные образцы отражаются на тесте RIF / INH для диагностики МЛУ-ТБ в течение 10,5 часов [8, 14]. Анализ Roche COBAS MTB также использует полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в режиме реального времени для обнаружения MTBC и может генерировать результаты для 96 тестов за один 3,5-часовой цикл, при этом положительные образцы, отраженные в анализе RIF / INH для диагностики МЛУ-ТБ, дополнительно 3,5 часа спустя [15]. Анализ Hain FluoroType MTBDR основан на ПОЗДНЕЙ ПЦР-амплификации и химии включения / выключения света для определения устойчивости к MTBC и изониазиду (INH) и RIF для 94 образцов в течение 4 часов [16].В настоящее время разрабатывается новый метод определения устойчивости к FQ и инъекционным препаратам второй линии (SLI) с использованием той же технологии [13]. Тест BD Max MDR-TB — это еще один анализ ПЦР в реальном времени, который можно запустить в системе BD MAX System для выявления устойчивости к MTBC, INH и RIF в 22 образцах мокроты за 4 часа [11]. Целевые анализы секвенирования следующего поколения также станут вариантом универсального централизованного ТЛЧ к туберкулезу в ближайшем будущем [17]. Один новый тест, который в настоящее время разрабатывается для расширенного DST в децентрализованных условиях, — это анализ Xpert MTB / XDR (Cepheid), который можно запустить на платформе GeneXpert для определения устойчивости к INH, FQ и SLI [12].Анализ Molbio Truenat (MolBio Diagnostics Pvt Ltd, Гоа, Индия), который позволяет обнаруживать устойчивость к MTBC и RIF, был недавно одобрен для использования в Индии и проходит испытания для обзора ВОЗ [18]. Обзор дополнительных анализов DST, находящихся в разработке, проходящих валидацию или одобрение регулирующих органов, доступен через диагностический конвейер FIND (Foundation for Innovative New Diagnostics) [19].

Все эти тесты на ТЛЧ к туберкулезу заявляют о высокой чувствительности и специфичности для выявления резистентности в клинических образцах туберкулеза.Многие из них обладают дополнительными характеристиками, которые имеют дополнительную ценность, включая поливалентность, то есть обнаружение и дифференциацию нетуберкулезных микобактерий (НТМ) и вирусов (например, вируса иммунодефицита человека) на одной платформе, и / или возможность подключения к платформе для облегчения отчетности и обмена результатами ( Таблица 2) [5]. Производители должны по возможности предоставлять данные об этих дополнительных характеристиках. Учитывая недавнее обновление руководств ВОЗ по лечению лекарственно-устойчивого туберкулеза [20], вполне вероятно, что вскоре будут разработаны новые анализы, которые также будут проверять устойчивость к новым лекарствам (например, бедаквилину и / или линезолиду), если молекулярная основа устойчивости к ним препараты хорошо определены [21].Аналогичные соображения по дизайну исследования будут применяться к этим тестам.

Таблица 2. Рабочие характеристики анализа

a

USE
• Общее время, необходимое для выполнения анализа
• Общее количество шагов, необходимых от приема образца до выдачи результата (и время для подшагов, например, экстракции ДНК)
• Время до получения первого результата (от приема образца до вывода результата)
• Простота использования и оценка пользователем с течением времени (сравнение в 2 разных временных точках: после обучения и в конец исследования)
• Потребности в обучении (например, количество прогонов, необходимых для достижения профессионального уровня во время обучения, предыдущие потребности в технических знаниях, время прохождения проверки квалификации)
АНАЛИЗ
• Эффективность партии (минимум, максимум)
• Рабочие температуры анализа (минимум, максимум)
• Требуемый объем образца количество реагентов (минимум, максимум), в том числе по типу образца
• Требования к хранению реагентов, включая возможность повторного использования между циклами, срок годности
• Использование / отходы реагентов (например, объем, в котором поступают реагенты, объем реагентов, необходимый для проверьте, как долго реагенты могут храниться после открытия / размораживания и т. д.) и методы утилизации
• Изменчивость от партии к партии (на основе информации, предоставленной производителем) или проблемы с качеством реагентов в соответствии с поступающим качеством Результаты проверки
• Требования к транспортировке и хранению (например, для реагентов требуется холодовая цепь для транспортировки)
• Датирование стабильности реагентов (например, средний срок годности с даты отгрузки, срок годности с момента первого использования)
ПРИБОР
• Стабильность прибора
• Требования к напряжению и мощности
• Поливалентность: другое тесты, доступные на приборе
• Произвольный доступ
• Минимальные требования к инфраструктуре для тестирования, включая площадь, хранение и удаление отходов
• Частота отказов прибора (как связанные с устройством, так и связанные с пользователем ошибки )
• Потенциал загрязнения ДНК (на основе информации, предоставленной производителем) и фактическое количество событий (например, если они очевидны, на основе серии ложноположительных результатов индексного теста после обработки положительного образца)
• Потребности в обслуживании и поддержке клиентов, основанные на проблемах, о которых сообщают сайты, и периодических оценках, а также рекомендуемых интервалах обслуживания
• Интеграция с лабораторными информационными системами, удаленный доступ для технической поддержки и мониторинга устройств, ключевые показатели производительности
32 906
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
• Всего все время, необходимое для проведения анализа
• Общее количество шагов, необходимых от приема образца до вывода результата (и время, необходимое для подшагов, например, экстракции ДНК)
• Время до получения первого результата (от образца от приема до вывода результатов)
• Простота использования и оценка пользователей с течением времени (сравнение в 2 разных временных точках: после обучения и в конце обучения)
• Потребности в обучении (например, количество прогонов, необходимых для достижения профессиональных навыков во время обучения, предварительные потребности в технических знаниях, время для прохождения проверки квалификации)
АНАЛИЗ
• Эффективность партии (минимальная, максимальная)
• Рабочая температура анализа (минимальная, максимальная)
• Требования к объему образца (минимальный, максимальный), в том числе по типу образца
• Требования к хранению реагентов, включая возможность повторного использования b между запусками, срок хранения
• Использование / отходы реагентов (например, объем, в котором поступают реагенты, объем реагентов, необходимый для проведения теста, как долго реагенты могут храниться после открытия / оттаивания и т. д.) и методы утилизации
• Изменчивость от партии к партии (на основе информации, предоставленной производителем) или проблемы с качеством реагентов в соответствии с результатами входящей проверки качества
• Требования к транспортировке и хранению (например, для реагентов требуется холодовая цепь для транспортировки)
• Датирование стабильности реагента (например, средний срок годности с даты отгрузки, срок годности с момента первого использования)
ПРИБОР
• Стабильность прибора
• Требования к напряжению и мощности 27
• Поливалентность: другие тесты доступны на приборе
• Произвольный доступ
• Минимальные требования к инфраструктуре размеры для тестирования, включая площадь, хранение и удаление отходов
• Частота отказов прибора (как связанные с устройством, так и ошибки пользователя)
• Возможность заражения ДНК (на основе информации, предоставленной производителем) и фактическая количество событий (например, если они очевидны, на основе серии ложноположительных результатов индексных тестов после обработки положительного образца)
• Потребности в техническом обслуживании и поддержке клиентов, основанные на проблемах, о которых сообщают сайты, и периодических оценках, а также рекомендуемые интервалы обслуживания
• Интеграция с лабораторными информационными системами, удаленный доступ для технической поддержки и мониторинга устройств, ключевые показатели эффективности
Таблица 2.

Рабочие характеристики анализаa

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
• Общее время, необходимое для выполнения анализа
• Общее количество шагов, необходимых от приема образца до вывода результата (и время, необходимое для подшагов, например, выделение ДНК)
• Время до получения первого результата (от приема образца до вывода результата)
• Простота использования и оценка пользователем с течением времени (сравнение в 2 разных временных точках: после обучения и в конце исследования)
• Потребности в обучении (например, количество прогонов, необходимых для достижения квалификации во время обучения, предыдущие потребности в технических знаниях, время для прохождения проверки квалификации)
АНАЛИЗ
• Эффективность партии (минимум, максимум)
• Рабочие температуры анализа (минимум, максимум)
• Требования к объему образца ( минимум, максимум), в том числе по типу образца
• Требования к хранению реагентов, включая возможность повторного использования между прогонами, срок годности
• Использование / отходы реагентов (например, объем, в котором поступают реагенты, объем реагентов, необходимый для запуска тест, как долго реагенты могут храниться после открытия / размораживания и т. д.) и методы утилизации
• Изменчивость от партии к партии (на основе информации, предоставленной производителем) или проблемы с качеством реагентов согласно результатам входящей проверки качества
• Требования к транспортировке и хранению (например, реагенты требуют холодовой цепи для транспортировки)
• Датирование стабильности реагента (например, средний срок годности с даты отгрузки, срок годности с момента первого использования)
ПРИБОР
• Стабильность прибора
• Требования к напряжению и мощности
• Поливалентность: другие тесты ava возможно на приборе
• Произвольный доступ
• Минимальные требования к инфраструктуре для тестирования, включая площадь, хранение и удаление отходов
• Частота отказов прибора (как связанные с устройством, так и связанные с пользователем ошибки)
• Потенциал загрязнения ДНК (на основе информации, предоставленной производителем) и фактическое количество событий (например, если они очевидны, на основе серии ложноположительных результатов индексного теста после обработки положительного образца)
• Техническое обслуживание и потребности клиентов в поддержке на основе проблем, о которых сообщают сайты, и периодических оценок, а также рекомендуемых интервалов обслуживания
• Интеграция с лабораторными информационными системами, удаленный доступ для технической поддержки и мониторинга устройств, ключевые показатели производительности
• Поливалентность: другие тесты доступны на приборе
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
• Всего рук- вовремя, необходимое для выполнения анализа
• Общее количество шагов, необходимых от приема образца до вывода результата (и время, необходимое для подшагов, например, экстракции ДНК)
• Время до получения первого результата (от приема образца до результата результат)
• Простота использования и оценка пользователей с течением времени (сравнение в 2 разных временных точках: после обучения и в конце обучения)
• Потребности в обучении (например, количество прогонов, необходимых для достижения мастерства во время обучение, предварительные технические требования, время для прохождения проверки квалификации)
АНАЛИЗ
• Эффективность партии (минимум, максимум)
• Рабочие температуры анализа (минимум, максимум)
• Требования к объему образца (минимальный, максимальный), в том числе по типу образца
• Требования к хранению реагентов, включая возможность повторного использования между ru нс, срок хранения
• Использование / отходы реагентов (например, объем, в котором поступают реагенты, объем реагентов, необходимый для проведения теста, как долго реагенты могут храниться после открытия / размораживания и т. д.) и методы утилизации
• Изменчивость от партии к партии (на основе информации, предоставленной производителем) или проблемы с качеством реагентов в соответствии с результатами входящей проверки качества
• Требования к транспортировке и хранению (например, реагентам требуется холодовая цепь для транспортировки)
• Датирование стабильности реагента (например, средний срок годности с даты отгрузки, срок годности с момента первого использования)
ПРИБОР
• Стабильность прибора
• Требования к напряжению и мощности
• Произвольный доступ
• Минимальные требования к инфраструктуре f или тестирование, включая площадь, хранение и утилизацию отходов
• Частота отказов прибора (как связанные с устройством, так и ошибки пользователя)
• Возможность заражения ДНК (на основе информации, предоставленной производителем) и фактическое количество событий (например, если они очевидны, на основании серии ложноположительных результатов индексных тестов после обработки положительного образца)
• Потребности в техническом обслуживании и поддержке клиентов, основанные на проблемах, о которых сообщают сайты, и периодических оценках, а также рекомендуемых интервалы обслуживания
• Интеграция с лабораторными информационными системами, удаленный доступ для технической поддержки и мониторинга устройств, ключевые показатели эффективности

ОБЩИЕ СООБРАЖЕНИЯ ПРИ ПРОЕКТИРОВАНИИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Следует рассмотреть два типа исследований для оценки точности и надежности новых анализов на ТЛЧ для поддержки процессов разработки политики ВОЗ и страны: (1) аналитические исследования в лабораторных условиях для подтверждения предела обнаружения анализов на MTBC и определение устойчивости; и (2) клинические оценочные исследования для подтверждения диагностической эффективности клинических образцов, собранных из последовательных серий или случайной выборки невыбранных пациентов, которым требуется оценка на ТБ и ЛУ-ТБ в местах предполагаемого использования (Приложение 1: Глоссарий).Вместе эти исследования могут предоставить репрезентативные данные о характеристиках анализов и приборов для использования в странах с высоким бременем ТБ и их применимости в различных клинических условиях и группах населения (Таблица 3). Оценки простоты использования и другие оценки (см. Таблицу 1 в статье 1 Denkinger et al) также являются обязательными, но здесь не рассматриваются.

Таблица 3.

Использование данных аналитических и клинических оценочных исследований для решения задач a

Головка для LPA 900 -6
. . Аналитическое исследование . .
Оценено . Характеристика . Панель LoD . Панель сопротивления . Клиническое исследование .
Обнаружение MTB Чувствительность b
Специфичность c
Сопротивление (Xpert) d
Обнаружение сопротивления
Специфичность
Прямой против пеллет
Оперативный характеристики Различный
Головка для LPA 900 -6
. . Аналитическое исследование . .
Оценено . Характеристика . Панель LoD . Панель сопротивления . Клиническое исследование .
Обнаружение MTB Чувствительность b
Специфичность c
Сопротивление (Xpert) d
Обнаружение сопротивления
Специфичность
Прямой против пеллет
Оперативный характеристики Различный
Таблица 3.

Использование данных аналитических и клинических оценочных исследований для достижения целей a

Головка для LPA 900 -6
. . Аналитическое исследование . .
Оценено . Характеристика . Панель LoD . Панель сопротивления . Клиническое исследование .
Обнаружение MTB Чувствительность b
Специфичность c
Сопротивление (Xpert) d
Обнаружение сопротивления
Специфичность
Прямой против пеллет
Оперативный характеристики Различный
Головка для LPA 900 -6
. . Аналитическое исследование . .
Оценено . Характеристика . Панель LoD . Панель сопротивления . Клиническое исследование .
Обнаружение MTB Чувствительность b
Специфичность c
Сопротивление (Xpert) d
Обнаружение сопротивления
Специфичность
Прямой против пеллет
Оперативный характеристики Различное

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Независимые аналитические исследования дополнят и подтвердят то, что производители производят для проверки своих анализов.Эти исследования должны проводиться в лабораторных условиях в рамках анализа с привязкой к дизайну для оценки пределов обнаружения MTBC и устойчивости, аналитической чувствительности и специфичности, инклюзивности и исключительности, а также обнаружения гетерорезистентности по ряду хорошо охарактеризованных образцов.

Предел обнаружения

Учитывая, что проспективные клинические исследования страдают от изменчивости исследуемой популяции пациентов (с течением времени, в разных географических регионах или в разных зонах обслуживания), аналитические исследования предела обнаружения (LoD), выполненные на стандартизированной панели и с использованием хорошо охарактеризованных сравнительных анализов, могут обеспечить LoD, который можно сравнивать в разных анализах.В идеале тестирование LoD должно проводиться в проверенной матрице мокроты, чтобы собрать достаточно данных, чтобы соответствовать кривой Пробита и оценить LoD с доверительным интервалом 95%. Учитывая обширные данные, доступные по Xpert MTB / RIF и Ultra, рекомендуется включить любой анализ в качестве прямого компаратора для проведения сравнительного анализа. Результаты должны подтвердить, что LoD анализа для MTBC эквивалентен или превосходит, по крайней мере, тот, который указан для Xpert MTB / RIF [17], в соответствии с критериями TPP [5], хотя снижение чувствительности может быть приемлемым, если другие характеристики анализа существенно улучшат доступность. и доступ [22].Проверка предела обнаружения против Ultra может быть особенно полезна для высокочувствительных анализов DST для информирования о размещении в алгоритмах тестирования (например, для использования в качестве предварительного или рефлекторного теста).

Следует также подтвердить LoD для целей устойчивости к ТЛЧ, потому что эти оценки, вероятно, будут отличаться от оценок для обнаружения MTBC из-за обнаружения различных и множественных генных целей. В этой оценке тестирование наиболее распространенных мутаций устойчивости (например, katG 315ACC для устойчивости к INH; rpoB 531TTG для устойчивости к RIF; gyrA 94GGC для устойчивости к FQ; rplC T460C для устойчивости к линезолиду; pncA a-11g для устойчивости к пиразинамиду и rrs A1401G для обнаружения устойчивости к SLI) можно использовать для определения LoD для тестирования устойчивости к некоторым соединениям первого и второго ряда, обнаруживаемым с помощью анализа [23].Анализы с линейным зондом (LPA) могут быть включены в качестве компараторов для соответствующих лекарственных соединений. В идеале результаты этого тестирования должны подтверждать, что анализ LoD для определения устойчивости эквивалентен или превосходит одобренные ВОЗ компараторы.

Следует отметить, что для оценки LoD следует использовать только генетически и фенотипически хорошо охарактеризованные и количественно определенные образцы. В отсутствие международного стандарта ВОЗ стандартизированная панель для определения динамического диапазона и LoD доступна в FIND и Zeptometrix [24].Разработчики анализов должны рассмотреть возможность использования по крайней мере 1 лекарственно-чувствительного и 1 лекарственно-устойчивого штамма из такой панели для оценки LoD анализов DST, чтобы повысить уверенность в LoD анализа как для MTBC, так и для обнаружения устойчивости.

Обнаружение мутаций, вызывающих резистентность

В ходе этого аналитического исследования также следует оценить способность обнаруживать мутации в устойчивых штаммах. Это необходимо, потому что ни одно клиническое исследование разумного размера не сможет достичь достаточного разнообразия штаммов и мутаций, придающих устойчивость, чтобы адекватно повлиять на эффективность анализа.В идеале анализы должны быть протестированы против панелей мутаций, которые включают мутации устойчивости с высокой степенью достоверности заметной глобальной распространенности, охватывающие примерно 80–90% известных механизмов устойчивости к любому лекарству. Например, мутации katG 315ACC и inhA C-15T представляют 80,8% глобальных механизмов устойчивости к INH, согласно недавним данным классификации мутаций [23]. В идеале 3 независимых штамма из разных регионов ВОЗ должны быть протестированы на каждую мутацию, чтобы гарантировать высокую воспроизводимость результатов анализа ТЛЧ для эпидемиологически разнообразного набора штаммов с соответствующими мутациями устойчивости.Следует отметить, что эта оценка требует тестирования на панелях штаммов, фенотипически охарактеризованных с помощью тестов, одобренных ВОЗ, включая фенотипическое ТЛЧ на твердой или жидкой среде в рекомендуемых критических концентрациях [25] и секвенирование для определения генетической основы устойчивости. К существующим высококачественным банкам штаммов ВОЗ относятся банк штаммов FIND TB с разнообразием генетически и клинически хорошо охарактеризованных устойчивых штаммов и подобранных клинических образцов [26], а также Институт тропической медицины (Антверпен, Бельгия) [27, 28], в котором содержится широкий спектр изолятов MTBC.

Инклюзивность и эксклюзивность

Аналитические исследования должны также оценивать инклюзивность и эксклюзивность анализа DST, тестировать реактивность анализа против ряда вариантов MTBC (инклюзивность), а также против других организмов (исключительность). Хотя использование эпидемиологически разнообразного набора штаммов во время экспериментов с контрольным заражением мутацией может дать данные, касающиеся инклюзивности анализа, следует позаботиться о том, чтобы анализ был адекватно проверен против вариантов MTBC.Также следует подтвердить, что анализ идентифицирует всех различных членов MTBC как TB. Для тестирования на исключительность следует проверить ряд NTM, грамположительных и отрицательных бактерий, особенно тех, которые присутствуют в флоре полости рта и мокроте [29]. Рекомендуется, чтобы в ходе этой оценки было протестировано не менее 20 клинически значимых НТМ и не менее 10 других бактерий без наблюдаемых перекрестных реакций. Такая панель доступна через Европейскую сеть референс-лабораторий по туберкулезу, а другая в настоящее время разрабатывается и будет доступна через FIND.Это тестирование может быть дополнено оценкой in silico данных о последовательности, с целью изучения перекрестной реактивности аналитического праймера и зондов со всеми известными клинически значимыми NTM и патогенами. Наконец, следует оценить интерференционные эффекты NTM или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) человека в смешанных образцах, чтобы подтвердить функциональность анализа в этих случаях [5].

Обнаружение гетерорезистентности

Обнаружение гетерорезистентности также следует оценивать в ранних аналитических исследованиях.Реплицируемые смеси штаммов дикого типа и мутантных штаммов или ДНК следует тестировать с помощью анализа в контексте LoD в установленных соотношениях для наиболее распространенных мутаций устойчивости в каждой области гена, включенной в анализ [23]. Эти соотношения могут быть шире или уже в зависимости от типа тестируемого анализа. Например, технология секвенирования следующего поколения, вероятно, будет иметь более низкий порог для тестирования устойчивости, и поэтому может быть более узкий диапазон смесей (например, 0,5%, 1%, 2%, 5% и 10% мутант: дикий тип). тестировали, сравнивая с анализом в реальном времени (например, 10%, 25%, 50%, 75% и 90% мутант: дикий тип).

КЛИНИЧЕСКИЕ ОЦЕНКИ

После подтверждения адекватных аналитических характеристик следует провести клинические исследования для оценки диагностической эффективности тестов на ТЛЧ на ТБ на образцах от пациентов в условиях предполагаемого использования. Данные, полученные в результате этих исследований по точности анализа, можно сопоставить с ранними данными LoD и аналитическими характеристиками. Клинические исследования в дальнейшем внесут существенный вклад в определение диагностической специфичности, поддержат данные, полученные в ходе тестирования исключительности, и предоставят данные об эксплуатационных характеристиках для руководства политикой использования.

Население и условия

Клинические оценки должны проводиться в различных условиях, репрезентативных для эпидемии туберкулеза в странах с высоким бременем, чтобы изучаемая популяция точно соответствовала целевой группе в условиях предполагаемого использования. В идеале для этих исследований следует выбрать по крайней мере 3 участка из разных регионов ВОЗ. Выбор площадок в различных географических регионах также гарантирует, что данные об эксплуатационных характеристиках отражают особые проблемы, которые могут возникнуть в различных условиях.Набор пациентов на основе факторов риска ЛУ-ТБ (например, ранее леченные пациенты с ТБ) также может быть приемлемой стратегией для обогащения пациентов с М / ШЛУ-ТБ исследованиями ТЛЧ (дополнительные сведения о размере выборки приведены ниже).

Эталон и компараторы

Учитывая важность оценок точности при принятии клинических решений и разработке диагностических алгоритмов и клинических руководств, крайне важно, чтобы в оценочные исследования были включены надежный эталонный стандарт и информативные компараторы (таблица 4).В настоящее время методы ТЛЧ, основанные на культуре, являются наилучшим доступным эталонным стандартом для выявления MTBC и устойчивости, но эти методы не всегда воспроизводимы или точны, особенно для определения устойчивости [30, 31]. Хотя генотипические методы, такие как секвенирование, можно считать надежным методом подтверждения наличия мутаций, обнаруживаемых с помощью ТЛЧ к туберкулезу, не все механизмы генетической устойчивости известны для каждого препарата, и некоторые мутации могут не быть связаны с устойчивостью.

Таблица 4.

Преимущества и недостатки стандартных образцов и компараторов для диагностических оценочных исследований ЛУ-ТБ

Тест . Тип . Преимущества . Недостатки .
Фенотипическое ТЛЧ: MGIT960
Löwenstein-Jensen
Миддлбрук 7h20
Миддлбрук 7h21
(одобренный ВОЗ) Стандарт Широко неизвестная мутация в большинстве клинических случаев, где мутация
может показать мутацию или не идентифицированы с помощью целевого секвенирования
Клиническая значимость результатов хорошо установлена ​​
Медленно: от нескольких недель до месяцев до получения результатов
Трудно получить точные результаты для определенных лекарств (например, PZA)
При тестировании могут быть пропущены гетерорезистентность или мутации, которые придают устойчивость ниже допустимого уровня. критическая концентрация (т. е. тестирование MIC позволит лучше разрешить фенотипическую устойчивость)
Проблемы, связанные с биобезопасностью
Секвенирование: секвенирование по Сэнгеру
Целевое секвенирование следующего поколения
Полное геномное секвенирование
Пиросеквенирование
Стандарт Быстрое сравнение результатов с культурой
Обнаруживает мю течения, которые могут не тестироваться на устойчивость при фенотипическом ТЛЧ при единственной критической концентрации
Обнаружение гетерорезистентности
Известны не все мутации, придающие устойчивость
В определенных условиях может быть непомерно дорогостоящим
Потребность в высококачественной ДНК для полногеномного секвенирования требует этап культивирования
Отсутствие международных стандартов качества NGS (например, минимальных требований к охвату)
Сложные и непроверенные конвейеры анализа NGS
Фенотипическое ТЛЧ и секвенирование Составной эталонный стандарт Объединяет генетические и фенотипические данные для получения более полной картины резистентность Медленно из-за той же потребности в результатах, основанных на росте
NGS может быть непомерно дорогим в определенных настройках
Анализ линейного зонда Компаратор Быстрые результаты
Оценка основных сопротивлений INH, RIF, FQ и SLI -соответствующие области генов, которые будут включены во все молекулы r assays
Может потребоваться тестирование нескольких LPA (например, Hain MTBDR plus и MTBDR sl ) для получения полной информации компаратора DST
Открытый анализ увеличивает потенциал загрязнения
Требуется ручная интерпретация
Не обнаруживать дополнительные мутации устойчивости за пределами горячие точки гена-мишени (например, мутации кодона rpoB 491)
Анализы Xpert MTB / RIF и MTB / RIF Ultra Comparator Быстрые результаты
Оценить основные области гена, придающие устойчивость к RIF, которые будут включены в все молекулярные анализы
Автоматическая интерпретация
Предоставлена ​​ограниченная информация о ТЛЧ (только устойчивость к RIF)
Тест . Тип . Преимущества . Недостатки .
Фенотипическое ТЛЧ: MGIT960
Löwenstein-Jensen
Миддлбрук 7h20
Миддлбрук 7h21
(одобренный ВОЗ) Стандарт Широко неизвестная мутация в большинстве клинических случаев, где мутация
может показать мутацию или не идентифицированы с помощью целевого секвенирования
Клиническая значимость результатов хорошо установлена ​​
Медленно: от нескольких недель до месяцев до получения результатов
Трудно получить точные результаты для определенных лекарств (например, PZA)
При тестировании могут быть пропущены гетерорезистентность или мутации, которые придают устойчивость ниже допустимого уровня. критическая концентрация (т. е. тестирование MIC позволит лучше разрешить фенотипическую устойчивость)
Проблемы, связанные с биобезопасностью
Секвенирование: секвенирование по Сэнгеру
Целевое секвенирование следующего поколения
Полное геномное секвенирование
Пиросеквенирование
Стандарт Быстрое сравнение результатов с культурой
Обнаруживает мю течения, которые могут не тестироваться на устойчивость при фенотипическом ТЛЧ при единственной критической концентрации
Обнаружение гетерорезистентности
Известны не все мутации, придающие устойчивость
В определенных условиях может быть непомерно дорогостоящим
Потребность в высококачественной ДНК для полногеномного секвенирования требует этап культивирования
Отсутствие международных стандартов качества NGS (например, минимальных требований к охвату)
Сложные и непроверенные конвейеры анализа NGS
Фенотипическое ТЛЧ и секвенирование Составной эталонный стандарт Объединяет генетические и фенотипические данные для получения более полной картины резистентность Медленно из-за той же потребности в результатах, основанных на росте
NGS может быть непомерно дорогим в определенных настройках
Анализ линейного зонда Компаратор Быстрые результаты
Оценка основных сопротивлений INH, RIF, FQ и SLI -соответствующие области генов, которые будут включены во все молекулы r assays
Может потребоваться тестирование нескольких LPA (например, Hain MTBDR plus и MTBDR sl ) для получения полной информации компаратора DST. горячие точки гена-мишени (например, мутации кодона rpoB 491)
Анализы Xpert MTB / RIF и MTB / RIF Ultra Comparator Быстрые результаты
Оценить основные области гена, придающие устойчивость к RIF, которые будут включены в все молекулярные анализы
Автоматическая интерпретация
Предоставлена ​​ограниченная информация о ТЛЧ (только устойчивость к RIF)
Таблица 4.

Преимущества и недостатки стандартных образцов и компараторов для диагностических оценочных исследований ЛУ-ТБ

Тест . Тип . Преимущества . Недостатки .
Фенотипическое ТЛЧ: MGIT960
Löwenstein-Jensen
Миддлбрук 7h20
Миддлбрук 7h21
(одобренный ВОЗ) Стандарт Широко неизвестная мутация в большинстве клинических случаев, где мутация
может показать мутацию или не идентифицированы с помощью целевого секвенирования
Клиническая значимость результатов хорошо установлена ​​
Медленно: от нескольких недель до месяцев до получения результатов
Трудно получить точные результаты для определенных лекарств (например, PZA)
При тестировании могут быть пропущены гетерорезистентность или мутации, которые придают устойчивость ниже допустимого уровня. критическая концентрация (т. е. тестирование MIC позволит лучше разрешить фенотипическую устойчивость)
Проблемы, связанные с биобезопасностью
Секвенирование: секвенирование по Сэнгеру
Целевое секвенирование следующего поколения
Полное геномное секвенирование
Пиросеквенирование
Стандарт Быстрое сравнение результатов с культурой
Обнаруживает мю течения, которые могут не тестироваться на устойчивость при фенотипическом ТЛЧ при единственной критической концентрации
Обнаружение гетерорезистентности
Известны не все мутации, придающие устойчивость
В определенных условиях может быть непомерно дорогостоящим
Потребность в высококачественной ДНК для полногеномного секвенирования требует этап культивирования
Отсутствие международных стандартов качества NGS (например, минимальных требований к охвату)
Сложные и непроверенные конвейеры анализа NGS
Фенотипическое ТЛЧ и секвенирование Составной эталонный стандарт Объединяет генетические и фенотипические данные для получения более полной картины резистентность Медленно из-за той же потребности в результатах, основанных на росте
NGS может быть непомерно дорогим в определенных настройках
Анализ линейного зонда Компаратор Быстрые результаты
Оценка основных сопротивлений INH, RIF, FQ и SLI -соответствующие области генов, которые будут включены во все молекулы r assays
Может потребоваться тестирование нескольких LPA (например, Hain MTBDR plus и MTBDR sl ) для получения полной информации компаратора DST
Открытый анализ увеличивает потенциал загрязнения
Требуется ручная интерпретация
Не обнаруживать дополнительные мутации устойчивости за пределами горячие точки гена-мишени (например, мутации кодона rpoB 491)
Анализы Xpert MTB / RIF и MTB / RIF Ultra Comparator Быстрые результаты
Оценить основные области гена, придающие устойчивость к RIF, которые будут включены в все молекулярные анализы
Автоматическая интерпретация
Предоставлена ​​ограниченная информация о ТЛЧ (только устойчивость к RIF)
Тест . Тип . Преимущества . Недостатки .
Фенотипическое ТЛЧ: MGIT960
Löwenstein-Jensen
Миддлбрук 7h20
Миддлбрук 7h21
(одобренный ВОЗ) Стандарт Широко неизвестная мутация в большинстве клинических случаев, где мутация
может показать мутацию или не идентифицированы с помощью целевого секвенирования
Клиническая значимость результатов хорошо установлена ​​
Медленно: от нескольких недель до месяцев до получения результатов
Трудно получить точные результаты для определенных лекарств (например, PZA)
При тестировании могут быть пропущены гетерорезистентность или мутации, которые придают устойчивость ниже допустимого уровня. критическая концентрация (т. е. тестирование MIC позволит лучше разрешить фенотипическую устойчивость)
Проблемы, связанные с биобезопасностью
Секвенирование: секвенирование по Сэнгеру
Целевое секвенирование следующего поколения
Полное геномное секвенирование
Пиросеквенирование
Стандарт Быстрое сравнение результатов с культурой
Обнаруживает мю течения, которые могут не тестироваться на устойчивость при фенотипическом ТЛЧ при единственной критической концентрации
Обнаружение гетерорезистентности
Известны не все мутации, придающие устойчивость
В определенных условиях может быть непомерно дорогостоящим
Потребность в высококачественной ДНК для полногеномного секвенирования требует этап культивирования
Отсутствие международных стандартов качества NGS (например, минимальных требований к охвату)
Сложные и непроверенные конвейеры анализа NGS
Фенотипическое ТЛЧ и секвенирование Составной эталонный стандарт Объединяет генетические и фенотипические данные для получения более полной картины резистентность Медленно из-за той же потребности в результатах, основанных на росте
NGS может быть непомерно дорогим в определенных настройках
Анализ линейного зонда Компаратор Быстрые результаты
Оценка основных сопротивлений INH, RIF, FQ и SLI -соответствующие области генов, которые будут включены во все молекулы r assays
Может потребоваться тестирование нескольких LPA (например, Hain MTBDR plus и MTBDR sl ) для получения полной информации компаратора DST. горячие точки-мишени гена (например, мутации кодона rpoB 491)
Анализы Xpert MTB / RIF и MTB / RIF Ultra Comparator Быстрые результаты
Оценить основные области гена, придающие устойчивость к RIF, которые будут включены в все молекулярные анализы
Автоматическая интерпретация
Предоставлена ​​ограниченная информация о ТЛЧ (только устойчивость к RIF)

Учитывая потребность в полной картине лекарственной устойчивости и устранении несоответствий между индексным тестом и эталонным стандартом в исследованиях диагностической точности, использование составного эталонного стандарта, объединяющего информацию о генотипическом секвенировании и фенотипических результатов ТЛЧ, настоятельно рекомендуется.Преимущество составного эталонного стандарта состоит в том, что он помогает преодолеть ограничения отдельных эталонных тестов: если образец устойчив в соответствии с фенотипическим ТЛЧ или имеет известную мутацию, придающую устойчивость, образец классифицируется как устойчивый к лекарствам, но если оба фенотипа ТЛЧ и секвенирование указывают на чувствительность, образец классифицируется как лекарственно-чувствительный. Поскольку специфичность как фенотипического ТЛЧ, так и секвенирования высока, это создает более надежный эталонный стандарт и позволяет получить более полную картину эффективности диагностического анализа, как показано в недавней оценке Hain MTBDR plus Version 2 (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Германия) и Nipro NTM + MDRTB (Nipro Corporation, Осака, Япония) LPA [32].

Включение одобренных ВОЗ тестов в качестве компараторов в оценочные исследования также дает возможность сравнивать и генерировать более убедительные доказательства для обзора ВОЗ [33]. В частности, включение одобренных ВОЗ LPA и анализов Xpert MTB / RIF и / или Ultra может принести пользу как аналитическим, так и клиническим оценочным исследованиям, поскольку эти анализы, вероятно, будут нацелены на те же генные цели, что и индексные тесты для первой линии и в случае анализа второй линии Hain MTBDR sl (Hain Lifescience GmbH, Нерен, Германия) — определение устойчивости к FQ и SLI.В идеале оценочное исследование должно оценивать диагностическую точность индексного теста по сравнению с фенотипическим ТЛЧ, секвенированием и составным эталонным стандартом, а также сравнивать диагностические характеристики теста с включенными компараторами.

Размер выборки

Размер выборки является важным фактором при разработке клинических оценочных исследований. Размер выборки должен быть установлен таким образом, чтобы достичь намеченной точности оценок точности. На рисунке 1 показано, как точность оценок увеличивается с увеличением размера выборки, а также показано, где повышение точности связано с высокими затратами с точки зрения количества набранных пациентов.Для решений TB DST эти оценки могут быть основаны на оценках производительности TPP [5]. В идеале должны быть достигнуты чувствительность> 95% и специфичность ≥98% по сравнению с секвенированием для всех препаратов, включенных в анализ, в соответствии с минимально приемлемыми рабочими характеристиками TPP [5]. Кроме того, чувствительность должна быть> 90% для INH,> 95% для RIF и> 90% для FQ по сравнению с фенотипическим ТЛЧ, а специфичность ≥98% для выявления лекарственной устойчивости для препаратов первого и второго ряда, к которым проводится тест. способен идентифицировать резистентность [5], с выбранным размером выборки, обеспечивающим высокую достоверность полученных оценок диагностической эффективности.В идеале ширина целевых доверительных интервалов должна составлять ≤5% для оценок специфичности и ≤10% для оценок чувствительности (таблица 5). Оценки размера выборки также должны быть завышены, чтобы учесть количество прогонов индексных и эталонных тестов, которые, как ожидается, дадут неопределенные результаты или ошибки (например, <5% в соответствии с TPP). При расчетах следует также учитывать тот факт, что профили резистентности зарегистрированных пациентов, вероятно, будут различаться в зависимости от места проведения. Например, ожидаемые профили лекарственной устойчивости пациентов, поступивших в специализированный центр по лечению ЛУ-ТБ, будут отличаться от профилей, зарегистрированных в централизованной лаборатории в условиях низкой распространенности ТБ.

Таблица 5. Пример расчета размера выборки

для клинической оценки анализа на ТЛЧ на ТБ, определяющего устойчивость к изониазиду и рифампицину

31 31 31 70 6 -устойчивый
. MTB + пациенты a . . Оценка точки чувствительности / специфичности (95% ДИ) . Ширина 95% ДИ b .
Проверенные образцы 100% 700
Скрининговый тест недетерминантный 1% 7
Недетерминантная стойкость к молекулярным тестам 10% 70
Включено 79% 553 160 90% (84–94%) 10%
INH-восприимчивый 71% 393 98% (96–99%) 3%
23% 127 95% (90–98%) 8%
RIF-чувствительный 77% 426 98% (96–99%) 3%
31 31 31 70 6 -устойчивый
. MTB + пациенты a . . Оценка точки чувствительности / специфичности (95% ДИ) . Ширина 95% ДИ b .
Проверенные образцы 100% 700
Скрининговый тест недетерминантный 1% 7
Недетерминантная стойкость к молекулярным тестам 10% 70
Включено 79% 553 160 90% (84–94%) 10%
INH-восприимчивый 71% 393 98% (96–99%) 3%
23% 127 95% (90–98%) 8%
RIF-чувствительный 77% 426 98% (96–99%) 3%
Таблица 5.

Пример расчета размера выборки для клинической оценки теста на ТЛЧ на ТБ, определяющего устойчивость к изониазиду и рифампицину

31 31 31 70 6 -устойчивый
. MTB + пациенты a . . Оценка точки чувствительности / специфичности (95% ДИ) . Ширина 95% ДИ b .
Проверенные образцы 100% 700
Скрининговый тест недетерминантный 1% 7
Недетерминантная стойкость к молекулярным тестам 10% 70
Включено 79% 553 160 90% (84–94%) 10%
INH-восприимчивый 71% 393 98% (96–99%) 3%
23% 127 95% (90–98%) 8%
RIF-чувствительный 77% 426 98% (96–99%) 3%
31 31 31 70 6 -устойчивый
. MTB + пациенты a . . Оценка точки чувствительности / специфичности (95% ДИ) . Ширина 95% ДИ b .
Проверенные образцы 100% 700
Скрининговый тест недетерминантный 1% 7
Недетерминантная стойкость к молекулярным тестам 10% 70
Включено 79% 553 160 90% (84–94%) 10%
INH-восприимчивый 71% 393 98% (96–99%) 3%
23% 127 95% (90–98%) 8%
RIF-чувствительный 77% 426 98% (96–99%) 3%

Рисунок 1.

Точность оценок точности в зависимости от размера выборки. Линии показывают точность оценок точности как функцию размера выборки; Точечные оценки точности выбираются в соответствии с минимальными целями на основе профиля целевого продукта, т. е. чувствительностью 98% (синяя линия) для обнаружения целевых однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) устойчивости к рифампицину (RIF) и 95% (зеленая линия) ) для обнаружения SNP устойчивости к фторхинолонам (FQ), пиразинамиду (PZA), изониазиду (INH) и аминогликозидам (AG) и капреомицину по сравнению с генетическим секвенированием; специфичность 98% (синяя линия) для любого противотуберкулезного (ТБ) агента, для которого тест может определить устойчивость по сравнению с генетическим секвенированием; чувствительность 95% (зеленая линия) для обнаружения устойчивости к RIF и 90% (красная линия) для обнаружения устойчивости к FQ, PZA, INH и AG по сравнению с фенотипической культурой Ось Y показывает общую ширину 95% доверительного интервала для чувствительности и специфичности для заданный размер выборки.По оси абсцисс показано необходимое количество пациентов с лекарственно-устойчивым (ЛУ) -ТБ для достижения заданной точности чувствительности и количество пациентов без ЛУ-ТБ для достижения заданной точности для специфичности.

Рис. 1.

Точность оценок точности в зависимости от размера выборки. Линии показывают точность оценок точности как функцию размера выборки; Точечные оценки точности выбираются в соответствии с минимальными целями на основе профиля целевого продукта, т. е. чувствительностью 98% (синяя линия) для обнаружения целевых однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) устойчивости к рифампицину (RIF) и 95% (зеленая линия) ) для обнаружения SNP устойчивости к фторхинолонам (FQ), пиразинамиду (PZA), изониазиду (INH) и аминогликозидам (AG) и капреомицину по сравнению с генетическим секвенированием; специфичность 98% (синяя линия) для любого противотуберкулезного (ТБ) агента, для которого тест может определить устойчивость по сравнению с генетическим секвенированием; чувствительность 95% (зеленая линия) для обнаружения устойчивости к RIF и 90% (красная линия) для обнаружения устойчивости к FQ, PZA, INH и AG по сравнению с фенотипической культурой Ось Y показывает общую ширину 95% доверительного интервала для чувствительности и специфичности для заданный размер выборки.По оси абсцисс показано необходимое количество пациентов с лекарственно-устойчивым (ЛУ) -ТБ для достижения заданной точности чувствительности и количество пациентов без ЛУ-ТБ для достижения заданной точности для специфичности.

Расход пробы

При разработке клинической оценки теста на ТЛЧ на ТБ особое внимание следует уделять потоку образцов. Индексный тест следует проводить либо на необработанном, либо на обработанном клиническом образце, либо на обоих, в зависимости от целевого исходного материала для анализа.Контрольный тест и компаратор следует по возможности проводить на тех же образцах, что и индексный тест, чтобы обеспечить сопоставимость результатов. В случае тестов ТЛЧ на ТБ на основе мокроты индексный тест может быть выполнен дважды: один раз для прямого образца для оценки эффективности анализа для сырых образцов, а второй — для культивированного изолята вместе с контрольными методами и методами сравнения (рис. 2). Это двойное тестирование обеспечивает оценку эффективности анализа для 2 различных типов образцов и позволяет разрешить противоречащие друг другу результаты между тестами, выполненными на необработанном образце и на культивированном изоляте.Поток образцов должен также учитывать минимальный объем образца, необходимый для индексных, контрольных и сравнительных тестов, с учетом потенциальной потребности в повторении неопределенных результатов при обеспечении того, чтобы исследовательская деятельность соответствовала процедурам сбора и обработки образцов в клинических учреждениях и не создавала чрезмерной нагрузки. на участников исследования, как это может иметь место при получении нескольких образцов (см. более подробное обсуждение вопросов, относящихся к этой теме, в Документе 2).

Рисунок 2.

Пример рекомендуемого потока проб для клинических оценочных исследований. График отражает поток образцов для оценки раствора для определения лекарственной чувствительности (ТЛЧ) от туберкулеза (ТБ). Все молекулярные анализы следует проводить в соответствии со стандартными рабочими протоколами, предоставленными производителями, тогда как обращение с образцами и их обработка должны выполняться в соответствии с политикой и стандартами Национальной программы по борьбе с туберкулезом. После скрининга пациентов или образцов для включения в исследование следует собрать образцы мокроты и провести мазок на кислотоустойчивые бациллы и индикаторную пробирку роста микобактерий (MGIT) и культивирование Левенштейна-Йенсена (LJ) непосредственно для всех образцов в дополнение к индексный тест.После прямого тестирования следует провести фенотипическое ТЛЧ по MGIT для всех образцов с положительным посевом на соответствующие лекарственные соединения. Культивированные образцы также будут подвергаться последующему молекулярному тестированию с помощью сравнительных анализов и целевого секвенирования следующего поколения (NGS) соответствующих областей гена и другого индексного теста. NGS следует выполнять из культурального изолята для получения результатов секвенирования высокого качества. FM, флуоресцентная микроскопия.

Рисунок 2.

Пример рекомендуемого потока проб для клинических оценочных исследований.График отражает поток образцов для оценки раствора для определения лекарственной чувствительности (ТЛЧ) от туберкулеза (ТБ). Все молекулярные анализы следует проводить в соответствии со стандартными рабочими протоколами, предоставленными производителями, тогда как обращение с образцами и их обработка должны выполняться в соответствии с политикой и стандартами Национальной программы по борьбе с туберкулезом. После скрининга пациентов или образцов для включения в исследование следует собрать образцы мокроты и провести мазок на кислотоустойчивые бациллы и индикаторную пробирку роста микобактерий (MGIT) и культивирование Левенштейна-Йенсена (LJ) непосредственно для всех образцов в дополнение к индексный тест.После прямого тестирования следует провести фенотипическое ТЛЧ по MGIT для всех образцов с положительным посевом на соответствующие лекарственные соединения. Культивированные образцы также будут подвергаться последующему молекулярному тестированию с помощью сравнительных анализов и целевого секвенирования следующего поколения (NGS) соответствующих областей гена и другого индексного теста. NGS следует выполнять из культурального изолята для получения результатов секвенирования высокого качества. FM, флуоресцентная микроскопия.

Ключевые проблемы, выходящие за рамки точности

Существует дополнительная потребность в мониторинге и оценке других аспектов эффективности анализа, которые необходимо запланировать при планировании клинических исследований.Данные о работе анализа следует собирать с помощью анкет наблюдения за использованием и оценки пользователей во время клинических испытаний, чтобы в конечном итоге определить политику в отношении использования анализа. Различные технические и операционные параметры анализа, которые следует измерять во время клинических исследований, включая время получения результата, неопределенные показатели и другие факторы, которые также могут быть оценены вне клинического исследования, перечислены в таблице 2. Необходимость направления пробы и Следует также отметить сети передачи данных, особенно для централизованных решений DST.Кроме того, операторы должны проявлять особую осторожность при мониторинге и замечании потенциальных проблем перекрестного загрязнения при включении анализов ТЛЧ в лабораторный поток. Наконец, существуют важные соображения при интерпретации результатов клинических исследований, полученных при помощи эталонных стандартов и компараторов. Примечательно, что возможность различных технологий для обнаружения гетерорезистентности в клинических образцах может вызывать беспокойство, особенно для лекарств, для которых обычно наблюдаются устойчивые субпопуляции, таких как FQ [34, 35], где частота устойчивого аллеля может быть ниже порог обнаружения различных диагностических тестов.Эти популяции также могут быть устойчивыми или восприимчивыми к фенотипическому ТЛЧ, что может привести к несоответствиям между фенотипическим ТЛЧ и секвенированием, если секвенирование выполняется только на культуральном изоляте. По этой причине исследователи могут рассмотреть возможность сохранения образцов мокроты для последующего целенаправленного глубокого секвенирования для устранения несогласованности. Это гарантирует получение наиболее точных эталонных генотипических данных для клинических образцов, особенно когда индексный тест проводится непосредственно на клиническом образце.

Для анализа выявления MTBC важно, чтобы результаты анализировались по статусу мазка и истории ТБ пациента, чтобы учесть возможные ложноположительные результаты из-за остаточного ТБ в образцах и гарантировать, что клинические данные отражают точные оценки обнаружения MTBC. Эти соображения жизненно важны для обеспечения точной отчетности о результатах исследования, включая ключевые параметры эффективности анализа (подробное обсуждение вопросов, относящихся к этой теме, приведено в документе 2).

ВЫВОДЫ

По мере того, как новые тесты разрабатываются в соответствии с существующими TPP, должны быстро последовать соответствующие доказательства их производительности и эксплуатационных характеристик.Это обеспечит возможность выработки политических рекомендаций, что является первым шагом к доступу к этим тестам для пациентов с туберкулезом. Ожидается, что исследования, проводимые в соответствии с изложенным здесь планом, позволят получить высококачественные лабораторные и клинические данные, касающиеся эффективности анализа и рабочих характеристик, и поддержат обзор ВОЗ и возможные рекомендации.

Дополнительные данные

Дополнительные материалы доступны в Интернете по адресу The Journal of Infectious Diseases .Состоящие из данных, предоставленных авторами для удобства читателя, размещенные материалы не копируются и являются исключительной ответственностью авторов, поэтому вопросы или комментарии следует адресовать соответствующему автору.

Банкноты

Дополнение спонсорства. Это дополнение спонсируется FIND (Фонд инновационных новых диагностических средств) и стало возможным благодаря щедрой поддержке правительств Великобритании, Нидерландов, Германии и Австралии.

Возможный конфликт интересов. Все авторы: о конфликтах интересов не сообщалось. Все авторы подали форму ICMJE для раскрытия информации о потенциальном конфликте интересов.

Список литературы

1.

Всемирная организация здравоохранения

.

Global Tuberculosis Report 2018

.

Женева

:

Всемирная организация здравоохранения

;

2018

.2.

Shah

NS

,

Richardson

J

,

Moodley

P

и др.

Повышение лекарственной устойчивости туберкулеза с широкой лекарственной устойчивостью, Южная Африка

.

Emerg Infect Dis

2011

;

17

:

510

3

.3.

Kendall

EA

,

Azman

AS

,

Cobelens

FG

,

Dowdy

DW

.

Лечение МЛУ-ТБ как профилактика: прогнозируемое воздействие расширенного лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью на популяционном уровне

.

PLoS One

2017

;

12

:

e0172748

.4.

Шарма

A

,

Hill

A

,

Курбатова

E

и др.

Оценка будущего бремени туберкулеза с множественной и широкой лекарственной устойчивостью в Индии, Филиппинах, России и Южной Африке: исследование с математическим моделированием

.

Lancet Infect Dis

2017

;

17

:

707

15

.5.

Всемирная организация здравоохранения

. Отчет о совещании

: Профили высокоприоритетных целевых продуктов для новых средств диагностики туберкулеза: отчет совещания по консенсусу

.

Женева

:

Всемирная организация здравоохранения

;

2014

.6.

Гилпин

С

,

Коробицын

А

,

Вейер

К

.

Современные инструменты для диагностики лекарственно-устойчивого туберкулеза

.

Ther Adv Infect Dis

2016

;

3

:

145

51

.7.

Steingart

K

,

Schiller

I

,

Horne

DJ

,

Pai

M

,

Boehme

C

,

Dendukuri

.

Анализ Xpert MTB / RIF на туберкулез легких и устойчивость к рифампину у взрослых

.

Кокрановская база данных Syst Rev

2014

;

CD009593

.8.

Скотт

L

,

Дэвид

A

,

Нобл

L

и др.

Эффективность тестов Abbott Realtime MTB и MTB RIF / INH в условиях высокой коинфекции туберкулеза и ВИЧ в Южной Африке

.

J Clin Microbiol

2017

;

55

:

2491

501

.9.

Park

JE

,

Huh

HJ

,

Koh

WJ

,

Song

DJ

,

Ki

CS

,

Lee

NY

NY

.

Оценка эффективности анализа Cobas TaqMan MTB на респираторных образцах в соответствии с клинической заявкой

.

Int J Infect Dis

2017

;

64

:

42

6

.10.

Hillemann

D

,

Haasis

C

,

Andres

S

,

Behn

T

,

Kranzer

K

.

Валидация анализа FluoroType® MTBDR на определение устойчивости к рифампицину и изониазиду в изолятах комплекса Mycobacterium tuberculosis

.

J Clin Microbiol

2018

;

56

:

pii: e00072-18

.12.

Се

YL

,

Чакраворти

S

,

Армстронг

DT

и др.

Оценка молекулярного экспресс-теста на лекарственную чувствительность при туберкулезе

.

N Engl J Med

2017

;

377

:

1043

54

. 14.

Hofmann-Thiel

S

,

Молодцов

N

,

Антоненка

U

,

Hoffmann

H

.

Оценка тестов Abbott Realtime MTB и INH / RIF в реальном времени для прямого обнаружения комплекса Mycobacterium tuberculosis и маркеров резистентности в респираторных и внелегочных образцах

.

J Clin Microbiol

2016

;

54

:

3022

7

. 16.

Rice

JE

,

Reis

AH

Jr,

Rice

LM

,

Carver-Brown

RK

,

Wangh

LJ

.

Флуоресцентные сигнатуры для вариабельных последовательностей ДНК

.

Nucleic Acids Res

2012

;

40

:

e164

. 17.

Dolinger

DL

,

Colman

RE

,

Engelthaler

DM

,

Rodwell

TC

.

Удобные платформы на основе секвенирования нового поколения для диагностики лекарственно-устойчивого туберкулеза: перспективы на ближайшее будущее

.

Int J Mycobacteriol

2016

;

5

(

Дополнение 1

):

27

8

.18.

Nikam

C

,

Jagannath

M

,

Narayanan

MM

и др.

Быстрая диагностика Mycobacterium tuberculosis с помощью Truenat MTB: практический подход

.

PLoS One

2013

;

8

:

e51121

.20.

Всемирная организация здравоохранения

.

Использование технологий секвенирования нового поколения для обнаружения мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью, в комплексе Mycobacterium tuberculosis : Техническое руководство

.

Женева

:

Всемирная организация здравоохранения

;

2018

. 21.

Всемирная организация здравоохранения

.

Руководство ВОЗ по лечению туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и туберкулезом, устойчивым к рифампицину. Обновление 2018

.

Женева

:

Всемирная организация здравоохранения

;

2018

. 22.

Всемирная организация здравоохранения

.

ВОЗ рекомендует провести новый тест на туберкулез

.

Женева

:

Всемирная организация здравоохранения

;

2016

. 23.

Miotto

P

,

Tessema

B

,

Tagliani

E

et al.

Стандартизированный метод интерпретации связи между мутациями и фенотипической лекарственной устойчивостью у Mycobacterium tuberculosis

.

Eur Respir J

2017

;

50

:

1

13

. 25.

Всемирная организация здравоохранения

.

Технический отчет о критических концентрациях для тестирования лекарственной чувствительности противотуберкулезных препаратов, используемых для лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза

.

Женева

:

Всемирная организация здравоохранения

;

2018

.26.

Tessema

B

,

Nabeta

P

,

Valli

E

и др.

НАЙТИ банк штаммов туберкулеза: ресурс для исследователей и разработчиков, работающих над тестами на обнаружение Mycobacterium tuberculosis и соответствующей лекарственной устойчивости

.

J Clin Microbiol

2017

;

55

:

1066

73

. 27.

Vincent

V

,

Rigouts

L

,

Nduwamahoro

E

и др.

Банк штаммов туберкулеза TDR: ресурс для фундаментальной науки, разработки инструментов и диагностических услуг

.

Int J Tuberc Lung Dis

2012

;

16

:

24

31

. 28.

Натансон

CM

,

Куэвас

LE

,

Каннингем

J

и др.

Банк образцов туберкулеза TDR: ресурс для разработчиков диагностических тестов

.

Int J Tuberc Lung Dis

2010

;

14

:

1461

7

.30.

Kim

SJ

.

Тестирование лекарственной чувствительности при туберкулезе: методы и достоверность результатов

.

Eur Respir J

2005

;

25

:

564

9

. 31.

Van Deun

A

,

Aung

KJ

,

Bola

V

и др.

Тесты на лекарственную устойчивость к рифампицину при туберкулезе: бросая вызов золотому стандарту

.

J Clin Microbiol

2013

;

51

:

2633

40

.32.

Nathavitharana

RR

,

Hillemann

D

,

Schumacher

SG

, et al.

Многоцентровая оценка неэффективности генотипа hain MTBDRplus версии 2 и линейных зондов Nipro NTM + MDRTB для выявления устойчивости к рифампину и изониазиду

.

J Clin Microbiol

2016

;

54

:

1624

30

. 33.

Takwoingi

Y

,

Leeflang

MM

,

Deeks

JJ

.

Эмпирические доказательства важности сравнительных исследований точности диагностических тестов

.

Ann Intern Med

2013

;

158

:

544

54

. 34.

Каплан

G

,

Пост

FA

,

Морейра

AL

и др.

Mycobacterium tuberculosis Рост на поверхности полости: микросреда с нарушенным иммунитетом

.

Infect Immun

2003

;

71

:

7099

108

.35.

Zhang

X

,

Zhao

B

,

Liu

L

,

Zhu

Y

,

Zhao

Y

,

000 4 Qin

.

Субпопуляционный анализ гетерорезистентности к фторхинолону в изолятах Mycobacterium tuberculosis из Пекина, Китай

.

J Clin Microbiol

2012

;

50

:

1471

4

,36.

Уилсон

EB

.

Вероятный вывод, закон последовательности и статистический вывод

.

J Am Stat Assoc

1927

;

22L

:

209

12

.

© Автор (ы) 2019. Опубликовано Oxford University Press для Общества инфекционных болезней Америки. Все права защищены. Для получения разрешения обращайтесь по электронной почте: [email protected]

Дифференциальный результат универсального и селективного тестирования лекарственной чувствительности пациентов с туберкулезом в странах с высоким бременем туберкулеза: систематический обзор и метаанализ

Ключевые вопросы

Что уже известно?
  • Во всем мире зарегистрировано менее одной трети из 560 000 случаев лекарственно-устойчивого туберкулеза (ЛУ-ТБ).

  • Этот разрыв частично объясняется различиями в политике тестирования лекарственной чувствительности (ТЛЧ) между странами и внутри стран.

Какие новые выводы?
  • Хотя универсальное ТЛЧ является ключевым компонентом Стратегии «Положить конец туберкулезу», в существующей литературе есть несколько ограничений, которые затрудняют оценку добавленной стоимости универсального тестирования для выявления ЛУ-ТБ по сравнению с только выборочным тестированием групп высокого риска.

  • В отсутствие доказательств рандомизированных исследований мы обнаружили очень ограниченные репрезентативные данные по странам или регионам и лишь несколько исследований, в которых сравнивали стратегии целевого тестирования и универсального тестирования.

  • В разных исследованиях участники часто отбирались заранее, а истинно универсальный подход к ТЛЧ применялся редко.

Что означают новые результаты?
  • Учитывая значительные ресурсы, необходимые для обслуживания и эксплуатации универсальных систем DST, было бы очень важно провести дополнительные исследования дифференциального воздействия и экономической эффективности универсального DST по сравнению с целевым DST.

  • Эти данные помогут лучше информировать руководящие принципы для конкретных стран, определить приоритеты эффективных программных вмешательств и финансирования.

Введение

Стратегия ВОЗ «Положить конец туберкулезу» отдает приоритет ранней диагностике туберкулеза (ТБ), включая универсальные тесты на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) .1 2 Если устойчивость к ключевым лекарствам, таким как рифампицин и изониазид, не обнаружена, вероятность лечения неэффективность высока3. В 2018 году только половина из 3,2 миллиона бактериологически подтвержденных случаев легочного туберкулеза, зарегистрированных во всем мире, были протестированы на устойчивость к рифампицину (ОР), только одна треть из оценочных 560 000 случаев туберкулеза с лекарственной устойчивостью (ЛУ-ТБ) была зарегистрирована и только 59% получили дальнейшее ТЛЧ, помимо тестирования ОР, среди пациентов с лекарственно-устойчивым туберкулезом, зарегистрированных в 2018 г.1

Это несоответствие между расчетным бременем ЛУ-ТБ и количеством выявленных случаев представляет собой серьезную неудачу в управлении системой здравоохранения этого состояния, несмотря на тот факт, что ВОЗ рекомендует проводить по крайней мере тестирование РУ для всех выявленных случаев ТБ3. 4

Моделирующее исследование, которое проинформировало Стратегию «Покончить с туберкулезом», пришло к выводу, что выполнение быстрого ТЛЧ для выявления RR у пациентов до начала лечения будет наиболее рентабельным из нескольких стратегий тестирования и лечения ЛУ-ТБ с точки зрения увеличенных ежедневных скорректированных лет жизни, предотвращении туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) и предотвращении смертей.5 Те, у кого диагностирован РУ-ТБ, подлежат дальнейшему обследованию на предмет устойчивости к лекарствам следующего уровня, предлагаемым в схемах лечения второго ряда. В 2018 году ВОЗ также рекомендовала всем странам приложить все усилия для перехода к всеобщему тестированию изониазида в начале лечения ТБ в дополнение к рифампицину6

Однако универсальное ТЛЧ часто достигается только в странах с более высоким уровнем доходов. страны с низким бременем ТБ, а охват ТЛЧ существенно различается между странами с высоким бременем ТБ, а также с высоким бременем МЛУ-ТБ.1 7 8 Из-за ограничений финансирования, лабораторных возможностей и общих сбоев систем здравоохранения большинство стран с низким и средним уровнем доходов в настоящее время предлагают рутинное ТЛЧ только для пациентов с высоким риском ЛУ-ТБ (например, пациентов, не прошедших терапию или имеющих записи предыдущего лечения) .2

ТЛЧ на основе культур представляет собой золотой стандарт для оценки структуры устойчивости изолята ТБ. Существенный прогресс в укреплении лабораторных услуг и расширении возможностей культивирования был достигнут благодаря коллективным усилиям глобального партнерства через финансирование и техническое обучение.Однако высокая стоимость и сложные технические требования существенно затрудняют масштабное внедрение. Среди ключевых достижений ТЛЧ к туберкулезу за последние несколько лет были молекулярные технологии, такие как линейные зондовые анализы (LPA) для противотуберкулезных препаратов первого и второго ряда, анализ Xpert MTB / RIF (Xpert; Cepheid, Sunnyvale, Калифорния, США), а в последнее время — Molbio (Truenat MTB) и крупные централизованные платформы. Хотя тесты, отличные от GeneXpert и Molbio, по-прежнему требуют сложной инфраструктуры с уровнем биобезопасности 2 и поэтому выполняются в центральных лабораториях национальных программ борьбы с туберкулезом19, Xpert и Molbio позволяют идентифицировать бактерии ТБ и РУ-ТБ ближе к пациенту.10–12 Эти достижения в диагностике туберкулеза могут позволить расширить охват ТЛЧ на разных уровнях системы здравоохранения.

В этом систематическом обзоре оценивалась сравнительная эффективность универсальной ТЛЧ по сравнению с ТЛЧ, нацеленной на группы высокого риска, только для лучшего понимания потенциальных преимуществ одной стратегии по сравнению с другой.

Методы

Отчет об этом систематическом обзоре и метаанализе ведется в соответствии с рекомендациями «Предпочтительные элементы отчетности для систематических обзоров и метаанализов» (PRISMA) (см. Онлайн-дополнительный файл к контрольному списку PRISMA).13 Протокол этой работы был зарегистрирован в Международном проспективном реестре систематических обзоров (PROSPERO, идентификатор: CRD42017065030).

Критерии отбора

В исследованиях, подходящих для включения, сообщалось о количестве РУ-ТБ и / или МЛУ-ТБ среди общего числа пациентов, прошедших тестирование посредством универсального и / или выборочного проведения ТЛЧ. Для включения рассматривались перекрестные исследования, когортные исследования, рандомизированные и нерандомизированные контролируемые испытания, а также отчеты о программных оценках.Никаких конкретных ограничений не было наложено с точки зрения демографических и клинических характеристик (например, возраста, пола, статуса беременности, ВИЧ-статуса) изучаемой популяции, но мы исключили исследования, ориентированные исключительно на особые группы (например, профессиональные группы, заключенные и помещенные в лечебные учреждения). лиц). Кроме того, мы исключили какие-либо исследования диагностической точности, основанные на группах образцов с минимальными клиническими деталями. Материалы конференции и тезисы также были признаны неприемлемыми.

Стратегия поиска

Систематический поиск проводился в Medline (PubMed), EMBASE (Ovid), Global Health (Ovid), SCI-EXPANDED, CPCI-S, ESCI (Web of Science Core Collection), Cochrane Reviews и CENTRAL (Кокрановская библиотека) с 1 января 2007 г. по 28 июня 2019 г.Стратегия была разработана в сотрудничестве с медицинским библиотекарем (GG) с использованием комбинаций предметных заголовков (если применимо) и текстовых слов для концепций ТЛЧ и ЛУ-ТБ, ограничиваясь публикациями на английском, французском, итальянском, испанском или португальском языках. Полная стратегия поиска, используемая для PubMed, представлена ​​в дополнительном онлайн-файле.

Основные определения

Для целей данного исследования мы определили «универсальную» как любую стратегию ТЛЧ, при которой тестировались все люди, включенные в исследование, в отличие от «селективных» стратегий, при которых избранные группы высокого риска прошли ТЛЧ.Что касается методов ТЛЧ, мы различали «молекулярные тесты» (генотипические), определяемые как те, которые способны обнаруживать связанные с устойчивостью мутации в геноме Mycobacterium tuberculosis , и «культуральные» (фенотипические) тесты, определяемые как тесты на основе оценки роста изолята туберкулеза в присутствии данного лекарственного средства. Для целей этого обзора устойчивые случаи определялись как инфицированные штаммами MTB с RR или MDR.

Страны исследования были разделены в соответствии с бременем туберкулеза на «низкие» (заболеваемость туберкулезом ниже 50 случаев на 100 000), «средние» (от 50 до 100 случаев на 100 000) и «высокие» (заболеваемость более 100 случаев на 100 000). .Списки стран с высоким бременем ВОЗ использовались для дифференциации исследований, проводимых в районах с высоким бременем ТБ, МЛУ-ТБ или ТБ / ВИЧ, от других. Списки 2015 г. и обновление на 2016–2020 гг. Были рассмотрены в отдельных анализах8.

Мы обратились к классификации Всемирного банка, чтобы классифицировать исследуемые страны как страны с низким доходом, доходом ниже среднего, доходом выше среднего или высоким доходом. о валовом национальном доходе на душу населения в год начала исследования14. «Городские» и «сельские» районы были разделены на категории в соответствии с описаниями авторов.

Скрининг исследований и извлечение данных

Все записи, полученные в результате нашего поиска, были импортированы в менеджер цитирования (EndNote X9, Clarivate Analytics). Два автора (AS и GS) независимо друг от друга проверили все публикации по названию и аннотации по заранее определенным критериям приемлемости, после чего провели полнотекстовый обзор тех, кто имел право; все тексты были извлечены дважды. Электронная форма для извлечения данных была опробована на пяти случайно выбранных документах, а затем использовалась для извлечения информации из включенных исследований.Полный список элементов данных, которые были собраны на этом этапе, представлен в дополнительном онлайн-файле. На протяжении всего процесса отбора и извлечения данных разногласия обсуждались до достижения консенсуса, и при необходимости проводились консультации со старшим автором (CMD). С авторами исследования связались, чтобы запросить разъяснения или дополнительные данные, если это необходимо.

Оценка качества исследования и систематической ошибки публикации

Переработанная версия существующего инструмента, разработанного Hoy et al. 15, использовалась для независимой оценки риска систематической ошибки в отдельных исследованиях AS и GS (см. Дополнительный файл в Интернете).Мы рассмотрели восемь конкретных вопросов, связанных с отбором участников, определениями случаев и используемыми методами, и присвоили каждому из них качественную оценку «высокий» или «низкий» риск. Сводные пункты для общего риска систематической ошибки исследования также были определены и оценены как «низкий», «средний» или «высокий» в соответствии с тем, что было предложено в исходном инструменте. Никаких числовых оценок не применялось. Мы не смогли провести формальную оценку систематической ошибки публикации, потому что традиционные подходы, такие как построение воронок и тесты на асимметрию, как известно, не подходят для данного типа включенных исследований.16

Статистический анализ

Для всех включенных исследований мы подсчитали долю устойчивых случаев, выявленных среди тех, кто тестировался с помощью различных стратегий ТЛЧ (универсальных или выборочных), как в целом, так и по стратам ключевых переменных, представляющих интерес (например, возраст, пол, ВИЧ-статус, предыдущий статус противотуберкулезного лечения, бремя ТБ или МЛУ-ТБ в стране, уровень дохода в стране). Мы использовали более консервативный метод Клоппера-Пирсона (или точный) для расчета 95% доверительных интервалов для каждой доли распространенности.

Мы планировали провести метаанализ случайных эффектов с преобразованием Фримена-Тьюки и без него, чтобы оценить общие пропорции.17 Поскольку мы ожидали значительного уровня неоднородности между исследованиями, мы объединили только достаточно однородные исследования, таким образом, выполнив различные заранее определенные анализы подгрупп (например, по категории страны бремени МЛУ-ТБ, предыдущему статусу лечения и т. Д.). Для оценки неоднородности использовались тест Хиггинса и интервалы прогнозирования (т. Е. Тип доверительного интервала, который обеспечивает 95% диапазон истинных значений, ожидаемых в аналогичных исследованиях ).18 19

Все анализы проводились в STATA (V.16; Stata). Corp, США).Для проведения метаанализа использовался пакет Metaprop.20 21

Участие пациентов и общественности

Было неприемлемо или невозможно вовлекать пациентов или общественность в разработку, проведение, отчетность или распространение планов нашего исследования.

Результаты

Наш поиск дал 38 506 записей, в результате чего было найдено 18 736 уникальных ссылок, из которых 101 была включена в анализ (рисунок 1). Основные характеристики включенных исследований приведены в таблице 1.22–122

Таблица 1

Основные характеристики включенных исследований

Рисунок 1 Блок-схема

PRISMA. МиО, мониторинг и оценка; МЛУ-ТБ, туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью; ПРИЗМА, Предпочтительные элементы отчетности для систематических обзоров и метаанализов.

Мы не выявили каких-либо рандомизированных испытаний, в которых сравнивали бы универсальные и селективные стратегии ТЛЧ. Мы нашли только обсервационные исследования, и все они были перекрестными, и большинство (88/101; 87,1%) включали группы высокого риска. Когда были проанализированы широкие популяционные исследования, мы обнаружили, что исследуемые образцы были довольно неоднородными по всем исследованиям.Подавляющее большинство (88/101; 87,1%) сообщили о результатах универсальных стратегий ТЛЧ. Однако, в то время как 37 (36,6%) / 101 включали все предполагаемые случаи ТБ, такое же количество исследований применяли мазок мокроты в качестве критерия предварительного отбора и включали только лиц с положительным мазком. В остальных исследованиях применялись еще более строгие критерии отбора (например, случаи с положительным посевом без четкого описания критериев, которые побудили поставщика медицинских услуг направить пациента на посев).

Выборочное тестирование было единственной стратегией, принятой в девяти исследованиях (семь из которых были проведены в странах с высоким бременем МЛУ-ТБ), с долей случаев ЛУ-ТБ от 12% (95% ДИ: от 8% до 17%). до 69% (95% ДИ: от 66% до 71%).32 86

Среди 87 исследований, которые предоставили некоторую информацию о возрасте пациентов, только 2 (2,0%) были сосредоточены на детях, 39 (38,6%) — на взрослых и 45 (44,6%) — на предметах любого возраста. Только 60 (59,4%) исследований сообщили о ВИЧ-статусе пациентов, и большинство из них (55/60; 91,7%) включали смешанную популяцию. Почти половина включенных исследований была проведена в Африканском регионе (48/101; 47,5%), 23 (22,8%) / 101 — в странах Юго-Восточной Азии и 14 (13,9%) / 101 — в Регионе Западной части Тихого океана.Большинство исследований проводилось в странах с уровнем дохода ниже среднего и в условиях высокой заболеваемости туберкулезом, при этом непропорционально представлены городские районы. Около двух третей исследований были проведены в странах с высоким бременем МЛУ-ТБ (69 по списку 2015 г. и 75 по классификации после 2015 г.).

Качество исследования

На рисунке 2 представлена ​​сводная информация о риске оценки систематической ошибки, а результаты оценки качества отдельных исследований представлены в дополнительном онлайн-файле.Общий риск систематической ошибки исследования был оценен как высокий для 78 (77,2%) / 101, средний — для 9 (8,9%) и низкий — для 14 (13,9%) исследований. Репрезентативность исследований была очень ограниченной. Большинство исследований проводились в одном или нескольких учреждениях, обычно ограничивались ограниченными географическими районами и не использовали какую-либо форму случайного отбора для идентификации участников. Примерно в 1 из 10 исследований были исключены пациенты с заранее заданными характеристиками, что увеличивало риск систематической ошибки отбора. Во всех исследованиях использовались одобренные ВОЗ диагностические методы и международные стандарты выявления предполагаемых случаев и классификации групп риска.Таким образом, как определение случая, так и валидность и надежность используемых методов ТЛЧ всегда считались адекватными.

Рисунок 2

Резюме оценки риска систематической ошибки исследования.

Прямое сравнение универсального и выборочного тестирования

Как показано в таблице 2, только четыре исследования напрямую сравнивали универсальные и избирательные стратегии ТЛЧ в одной и той же популяции 45 60 96 123 Распространенность случаев ЛУ-ТБ варьировалась от От 2,2% (95% ДИ: от 1,4% до 3,2%) до 12,8% (95% ДИ: 11.От 4% до 14,3%) с выборочным тестированием, от 60123 против 4,4% (95% ДИ: от 3,3% до 5,8%) до 9,8% (95% ДИ: от 8,9% до 10,7%) с универсальным тестированием60. 123 Оценки не объединялись. между исследованиями из-за небольшого количества доступных исследований.

Таблица 2

Основные результаты исследований, в которых сравнивались универсальные и выборочные стратегии тестирования

Все эти исследования были нерандомизированными, без явного намерения провести прямое сравнение различных стратегий. Более того, три из четырех исследований были проведены в Южной Африке, 45 60 85, а остальные — в Индии.96

В Индии Райзада и др. 96 охватили когорту ВИЧ-инфицированных с предполагаемым легочным туберкулезом, всем из которых было предложено пройти тестирование Xpert, независимо от их профиля риска ЛУ-ТБ; фенотипическое ТЛЧ проводилось только на образцах RR на основе тестирования Xpert. Доля устойчивых случаев, выявленных среди протестированных, была представлена ​​отдельно для случаев предполагаемого ЛУ-ТБ и других случаев, что позволило сравнить результаты выборочного тестирования только групп высокого риска с предоставлением универсального ТЛЧ.Однако все пациенты в исследовании были ВИЧ-инфицированы и, следовательно, сами по себе относились к группе высокого риска. Доля случаев ЛУ-ТБ, выявленных с помощью универсального тестирования, составила 9,5% (95% ДИ: от 7,5% до 11,8%) по сравнению с 11,2% (95% ДИ: от 6,5% до 17,5%) при выборочном тестировании. Как показано в таблице 2, распространенность РУ-ТБ, обнаруженная среди групп высокого риска в этом исследовании, отражает оценки ВОЗ для ранее леченных пациентов в Индии, хотя только 20,8% пациентов, включенных в исследование, имели известную историю ТБ.

Cox и его коллеги провели нерандомизированное исследование в двух группах в Южной Африке, в котором одна группа была назначена для универсального тестирования Xpert, а другая группа была назначена для рутинного диагностического обследования, при этом ТЛЧ проводилось только в том случае, если индивидуум считался высоким -риск (например, ранее леченный, любой тюремный контакт и т. д.).45 Среди протестированных количество устойчивых было невелико, а доля устойчивых составляла 11/199 (5,5%; 95% ДИ: от 2,8% до 9,7%) и 8/109 (7,3%; от 3,2% до 14,0%) для универсальных и выборочные стратегии соответственно. Тем не менее, исследование, вероятно, было недостаточно мощным для выявления значимых различий между группами.

Ханрахан и др. 60 были направлены на оценку воздействия внедрения метода LPA для быстрого выявления лекарственно-устойчивого туберкулеза в 25 государственных медицинских учреждениях Южной Африки. Исследователи использовали универсальное тестирование для всех предполагаемых случаев ТБ, а в избирательном алгоритме проводили ТЛЧ только для предполагаемых случаев ТБ с высоким риском МЛУ-ТБ.В этих условиях универсальное тестирование позволило выявить в два раза больше случаев резистентности, чем при выборе тестирования: 52/1177 (4,4%; 95% ДИ: от 3,3% до 5,8%) и 26/1176 (2,2%; 95% ДИ: От 1,4% до 3,2%) соответственно.

Наконец, Найду и его коллеги оценили пациентов, которые были идентифицированы в ходе предыдущего исследования ступенчатого клина, и сравнили выявление ЛУ-ТБ во время и после внедрения тестирования на основе Xpert.123 В этом исследовании группа «универсального ТЛЧ» включала всех предполагаемых Случаи туберкулеза, тогда как «выборочная» группа включала всех ранее пролеченных больных туберкулезом, больных туберкулезом в местах скопления людей или лиц, контактировавших с больными МЛУ-ТБ.123 Исследователи обнаружили, что 415/4235 (9,8%; 95% ДИ: от 8,9% до 10,7%) всех предполагаемых случаев ТБ (универсальное тестирование) имели МЛУ-ТБ, в то время как распространенность МЛУ-ТБ среди отдельных лиц с высоким риском составила по 269/2099 (12,8%; 95% ДИ: от 11,4% до 14,3%).

Высокий уровень неоднородности между исследованиями с точки зрения популяции, критериев отбора и настроек не позволил нам объединить оценки.

Результат универсального тестирования

При оценке 90 исследований, в которых применялся наиболее инклюзивный («универсальный») подход к тестированию, исследования были очень разнородными, и общая доля выявленных случаев ЛУ-ТБ колебалась от 0% в двух исследованиях, проведенных в США. Малави и Непал — до 52.8% в исследовании из Индии, в котором участвовали предполагаемые случаи ТБ с факторами риска ЛУ-ТБ и без них.39 44106 При оценке различного бремени ЛУ-ТБ, как указано в списке ВОЗ 2015 г., 62 исследования сообщили об универсальном ТЛЧ в страны с высоким бременем МЛУ-ТБ. Выход резистентных случаев, выявленных в ходе этих исследований, также широко варьировался от 0% до 86%. Даже если доля резистентных случаев была, как правило, намного выше среди ранее леченных (2–81%), чем среди новых пациентов (0–66%), различия между исследованиями были слишком заметными, чтобы можно было провести какой-либо дальнейший анализ или объединение. меньшими подгруппами.

Обследования распространенности

Из 37 исследований, в которых участвовали все пациенты с предполагаемым туберкулезом, только два были обследованиями распространенности. Noeske и др. провели поперечное исследование во всех 10 регионах Камеруна в течение 6 недель, включив в него всех взрослых, присутствующих в каждом центре тестирования с симптомами, совместимыми с туберкулезом легких. Явной целью этого исследования было оценить распространенность МЛУ-ТБ среди новых бактериологически подтвержденных случаев легочного ТБ, которая составила 2% (95% ДИ: от 1% до 3%).87

В другом исследовании Лукой и его коллеги собрали образцы из национальной репрезентативной выборки новых и ранее пролеченных пациентов с ТБ с положительным мазком мокроты, зарегистрированных в диагностических центрах ТБ в Уганде, с использованием метода взвешенной кластерной выборки. ТЛЧ к этим образцам выявило долю МЛУ-ТБ 1,4% (95% ДИ: от 0,6% до 2,2%) и 12,1% (95% ДИ: от 6,8% до 19,4%) для новых и ранее леченных пациентов, соответственно.75

Исследования из выбранных стран с высоким бременем МЛУ-ТБ

В попытке определить более однородные исследования мы сосредоточили свое внимание на четырех странах с высоким бременем МЛУ-ТБ (Китай, Эфиопия, Индия и Нигерия), по которым было доступно не менее пяти исследований. .В различных исследованиях диапазон доли устойчивых случаев, выявленных с помощью универсального тестирования, был следующим: 4–22% в Китае; 0–61% в Эфиопии; 0% –59% в Индии; и 0–44% в Нигерии. Объединенные оценки по странам показаны на рисунке 3 вместе с оценками ВОЗ для новых и ранее леченных пациентов. Лесные участки для оценок по конкретной стране, полученные в результате нашего метаанализа, представлены в дополнительном онлайн-файле.

Рисунок 3

Оценки распространенности ЛУ-ТБ в отдельных странах с высоким бременем МЛУ-ТБ.ЛУ-ТБ, лекарственно-устойчивый туберкулез; МЛУ-ТБ, туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью.

Широкий диапазон пропорций устойчивости в этих исследованиях указывает на большую неоднородность, которая была особенно выражена среди исследований из Эфиопии. По этой причине мы будем сообщать о подгруппе исследований в этих странах, в которых была произведена репрезентативная выборка в определенных условиях, но не на уровне страны (например, путем включения всех последовательных пациентов с предполагаемым туберкулезом в крупный справочный центр или определенный количество объектов в данной области).В пяти исследованиях, проведенных в Эфиопии в период с 2015 по 2019 год, доля случаев устойчивого туберкулеза варьировала от 4% до 16% 26 33 66 83 124 Jaleta и его коллеги обнаружили самую высокую долю устойчивых случаев: 16% всех пациентов с предполагаемым туберкулезом, которые посетил госпиталь Университета Гондэра ТБ DOTS в период с января 2013 г. по август 2015 г. имел лекарственно-устойчивый туберкулез, и большинство устойчивых случаев ранее лечились от туберкулеза, что свидетельствует о систематической ошибке отбора среди населения, обращающегося за помощью в специализированную больницу.66

Было проведено три исследования проведено в Индии.В двух исследованиях, проведенных Райзада и соавторами, изучалось педиатрическое население в четырех крупных городах (Ченнаи, Дели, Хайдарабад и Калькутта), и было обнаружено, что доля устойчивых случаев составляет 10% (95% ДИ: от 7% до 12%) и 9% (95% ДИ). : От 8% до 10%), соответственно.97 98 Напротив, Дас и его коллеги обнаружили наименьшую распространенность резистентности на уровне 2% (95% ДИ: от 1% до 6%). В это исследование были включены все пациенты с симптомами, указывающими на туберкулез, которые посещали специализированный центр микроскопии столичной больницы в Бхубанешваре, Одиша.50

Обсуждение

В то время как универсальная ТЛЧ является ключевым компонентом стратегии по борьбе с туберкулезом и похвальной целью2, существующая литература имеет несколько ограничений, которые затрудняют оценку дополнительных результатов универсального тестирования для выявления ЛУ-ТБ по сравнению с только выборочное тестирование групп высокого риска. Наш анализ не позволил глубже понять нашу основную цель — сравнить долю устойчивых случаев, выявленных с помощью различных стратегий тестирования. Это подчеркивает необходимость дополнительных сравнительных данных по универсальному и целевому ТЛЧ для принятия обоснованных решений по стратегиям внедрения.

В отсутствие рандомизированных доказательств мы обнаружили очень ограниченные репрезентативные данные по странам или регионам и лишь несколько исследований, в которых сравнивали стратегию целевого и универсального тестирования, что указывает на то, что участники исследования часто отбирались заранее, а истинный универсальный подход к ТЛЧ применялся редко.

Национальные репрезентативные исследования распространенности показали распространенность резистентности, сопоставимую с оценками ВОЗ.1 Например, Noeske et al. обнаружили 1,6% (95% ДИ: от 0,9% до 2.5%) распространенность МЛУ-ТБ среди новых бактериологически подтвержденных случаев легочного ТБ 87, что соответствует тому, что было зарегистрировано ВОЗ в Камеруне.1 В Уганде Лукойе и его коллеги обнаружили, что доля МЛУ-ТБ составляет 1,4% (95%). ДИ: от 0,6% до 2,2%) в новых случаях и 12,1% (95% ДИ: от 6,8% до 19,4%) в ранее леченных случаях75. % (95% ДИ: от 0,91% до 1,2%) и 12% (95% ДИ: от 6,5% до 19%) для новых и ранее леченных случаев соответственно.Следует отметить, что оценки ВОЗ были впервые оценены и представлены для каждой страны с 2018 года. Однако даже в течение 10-летнего периода, как в случае исследования в Уганде, мы не ожидаем существенных изменений в устойчивости. выкройки на общегосударственном уровне.

Другие исследования, в которых использовались репрезентативные методы выборки в определенных условиях, отражали местную распространенность, и большинство результатов существенно расходились с ожидаемой распространенностью РУ / МЛУ-ТБ в конкретной стране, полученной из обследований распространенности или оцененной ВОЗ на основе данных национального эпиднадзора.1 В тех случаях, когда для одной страны было доступно несколько исследований, показатель распространенности в конкретных условиях был самым высоким в специализированных центрах (например, в Эфиопии).

Даже четыре исследования, целью которых было сравнение универсального и избранного ТЛЧ, имели ограничения в отношении отбора популяции. Наиболее репрезентативное исследование было проведено в Южной Африке Hanrahan et al. , 60, что наиболее близко соответствует идеальному дизайну исследования, чтобы ответить на наш конкретный исследовательский вопрос. В этом исследовании еще более высокая доля устойчивости была обнаружена в группе универсального тестирования, что подчеркивает важность систематической оценки результатов универсального тестирования в отличие от более избирательных подходов.Такая оценка потенциально может дать разные результаты в разных странах и контекстах, отражая особенности местной эпидемиологии ТБ. Тем не менее, все четыре исследования показали, что универсальное ТЛЧ сможет выявить значительное количество дополнительных случаев с резистентностью в группах не высокого риска. Учитывая количество людей, не имеющих факторов риска, с предполагаемым туберкулезом, они могут быть существенным фактором развития эпидемии лекарственно-устойчивого туберкулеза.

Большинство исследований, в которых использовался универсальный подход к ТЛЧ, ограничивали исследуемые популяции определенными категориями людей, что сужало цель такого «универсального» тестирования.В то время как некоторые исследования включали все предполагаемые случаи ТБ, определенные в соответствии с международными рекомендациями, часто характер участков тестирования приводил к отбору.125 Другие включали только случаи с положительным результатом мазка мокроты, таким образом осуществляя предварительный отбор субъектов, которые в конечном итоге будут иметь доступ к ТЛЧ. . Это в основном обусловлено техническими ограничениями, когда некоторые тесты, например LPA, позволяют проводить надежные тесты только на образцах с положительным мазком126. отправляется для культивирования только при определенных обстоятельствах, особенно в условиях ограниченных ресурсов.Таким образом, тестирование не было универсальным, а было только репрезентативным для подгрупп населения и случаев ТБ.

Были включены только исследования, в которых использовались одобренные ВОЗ методы оценки лекарственной устойчивости 3, 4, таким образом, различия в методах оценки устойчивости между исследованиями вряд ли будут причиной гетерогенности. Однако следует отметить, что сами средства диагностики представляют собой совершенно разные технологии (например, LPA имеет очень разные возможности, использование, требования и т. Д. По сравнению с Xpert).

Несмотря на неубедительность доказательств о разной результативности универсального и выборочного тестирования, существует убедительное обоснование для интеграции рутинного ТЛЧ в диагностические алгоритмы для всех случаев ТБ. Проведение ТЛЧ для всех случаев ТБ дает ценную информацию о масштабах проблемы ЛУ-ТБ и имеет важное значение для оценки контрольных вмешательств, таких как рациональное использование лекарственных средств, соблюдение режима лечения и индивидуализированная медицина для улучшения результатов.3 4 Кроме того, при высоком риске группы могут иметь самое большое бремя лекарственной устойчивости, группы не высокого риска часто больше по размеру, и, таким образом, даже меньшее бремя устойчивости может отражать значительное количество резистентных случаев и, таким образом, является важным фактором устойчивости.

Однако, поскольку для установления и поддержания универсального ТЛЧ необходимы значительные ресурсы, было бы важно провести дополнительные исследования различного воздействия и экономической эффективности. Такая информация поможет лучше понять руководящие принципы для конкретных стран и расставить приоритеты для эффективных программных мероприятий и распределения финансовых средств.

Анализ затрат на экспресс-диагностику лекарственно-устойчивого туберкулеза | BMC Infectious Diseases

Дизайн исследования

Дизайн и методы исходного исследования были ранее описаны в другом месте [9].Вкратце, цель общего исследования заключалась в сравнении TTR и чувствительности / специфичности трех экспресс-тестов для диагностики туберкулеза с чрезвычайно высокой лекарственной устойчивостью (ШЛУ-ТБ) с ТЛЧ MGIT. ШЛУ-ТБ определяется как устойчивость к изониазиду и рифампицину, а также к любому из фторхинолонов и любому из инъекционных противотуберкулезных препаратов [1]. Диагностические тесты проводились параллельно с участниками исследования в трех крупных противотуберкулезных клиниках, расположенных в районах с повышенной распространенностью ШЛУ-ТБ. В исследование были включены участники с подозрением на наличие ШЛУ-ТБ (критерии включения / исключения см. В дополнительном файле 1: таблица S1) [9].Биологические образцы и данные интервью были собраны во время исходных и 52-недельных контрольных визитов. Кроме того, анализ медицинских карт проводился на исходном уровне, через 30 дней после зачисления и через 52 недели после зачисления. Регистрация происходила в период с июня 2012 года по июнь 2013 года. Участникам не была выплачена компенсация за участие, но дорожные расходы были возмещены, когда пациенты путешествовали на час или более для посещений, связанных с исследованиями.

Исследовательские центры

Три исследовательских центра были расположены в Мумбаи, Индия; Порт-Элизабет, Южная Африка; и Кишинев, Молдова.

Индия

The P.D. Национальная больница Хиндуджа (PD-HNH) и Центр медицинских исследований (MRC) — это центр третичной медицинской помощи в центре Мумбаи, Индия. Легочное отделение PD-HNH является самым загруженным в Мумбаи и является справочным центром для больных МЛУ и ШЛУ-ТБ из Мумбаи и штата Махараштра. В предыдущем исследовании популяции пациентов в этой клинике было обнаружено, что 80% полученных образцов устойчивы к одному или нескольким стандартным противотуберкулезным препаратам, а 51% — к нескольким лекарствам [16].

Молдова

Институт фтизиопневмологии (ИФП) в Кишиневе, Молдова, является центральным подразделением Национальной программы борьбы с туберкулезом. Это медицинский консультационный, научно-исследовательский и учебный центр, который руководит всеми услугами по лечению туберкулеза по всей Молдове. В Молдове высока распространенность лекарственно-устойчивого туберкулеза: 24% новых и 62% ранее леченных больных туберкулезом имеют МЛУ-ТБ [17].

Южная Африка

По данным ВОЗ, в Южной Африке большое количество случаев ТБ и высокая распространенность лекарственно-устойчивого ТБ [9].На объекте Порт-Элизабет пациенты были зарегистрированы в шести учреждениях первичной медико-санитарной помощи и одной региональной больнице. Децентрализованный набор привел к снижению распространенности лекарственной устойчивости на этом сайте [1].

Опыт и подготовка лабораторного персонала

В каждом из описанных выше исследовательских центров были существующие клинические лаборатории, которые работали много лет и соблюдали международные стандарты безопасности. Исследование требовало, чтобы каждое учреждение идентифицировало лаборанта с опытом проведения тестирования на ТБ не менее одного года.В каждом учреждении имеется постоянный опыт проведения тестов на лекарственную устойчивость к туберкулезу с использованием теста MGIT и линейного зонда. Для этих тестов каждому участку был отправлен набор образцов для тестирования, и результаты участка сравнивались с ранее установленными данными в координационном центре (UCSD). Лаборант с каждого объекта также совместно посетил недельный тренинг по MODS в Университете Перуана Cayetano Heredia в Лиме, ​​Перу, и недельный тренинг по пиросеквенированию с доктором Грейс Лин в Калифорнийском департаменте общественного здравоохранения, Ричмонд. Калифорния.Обучение состояло из лекций, лабораторных инструкций и практических занятий по установлению стандартизированных процедур тестирования на разных площадках.

Критерии включения / исключения

Для участия в исследовании участники должны были: а) быть не моложе 5 лет; б) предоставили информированное согласие или имели возможность и желание субъекта или законного опекуна / представителя дать информированное согласие; c) заведомо положительный результат мазка мокроты на КУБ (определяется как 1+ или более в течение предшествующих 14 дней), положительный результат на GeneXpert или клинически проявлен с высоким подозрением на активный ТБ и:

  • Ранее получали более 1 месяца лечения от предыдущего эпизода ТБ или

  • Не прошли лечение ТБ с положительными результатами мазка мокроты или посева после ≥3 месяцев стандартного лечения ТБ или

  • Имел тесный контакт с известным пациентом с лекарственно-устойчивым туберкулезом или

  • Были впервые диагностированы МЛУ-ТБ в течение последних 30 дней или

  • Были ранее диагностированы МЛУ-ТБ и неэффективное лечение ТБ с положительным результатом мазка мокроты или посева через ≥3 месяцев стандартной схемы лечения МЛУ-ТБ.

  • Критерии исключения: а) институционализированы; б) неспособность собрать как минимум 7,5 мл мокроты (1-й и 2-й пробы вместе) или в) результаты ТЛЧ второй линии были выполнены в течение последних 3 месяцев.

Измерения исследования

Эффективность

TTR каждого анализа был основным результатом эффективности. TTR был определен как «количество дней от начала тестирования до регистрации окончательных результатов всех семи препаратов для каждого теста».Дата отслеживалась и сообщалась на ключевых этапах обработки анализа. Чувствительность и специфичность каждого из трех новых тестов (MODS, LPA, PSQ) по сравнению с эталонным стандартом (MGIT) служили дополнительным показателем эффективности. Также фиксировалось наличие или отсутствие интерпретируемого результата.

Стоимость

Расходы на материалы и персонал для испытаний

Местные затраты на лабораторные материалы для конкретных тестов и затраты на персонал были собраны на каждом объекте с использованием опроса для каждого диагностического теста с использованием местной валюты.Чтобы обеспечить точность и единообразие сбора данных на разных сайтах, сотрудники прошли обучение с помощью веб- и телеконференций по заполнению опросов. Опросы проводились через 3–6 месяцев после начала зачисления, что позволило сайтам развить навыки по любым новым тестам. Стоимость каждой партии была указана, и была собрана информация о среднем размере партии. Персонал сайта был проинструктирован исключить расходы, связанные с исследованиями. Когда процессы распределялись между тестами, для каждого теста подсчитывалась полная стоимость этого процесса.Заполненные анкеты были просмотрены исследователями на координационном сайте. Были выявлены недостающие данные или несоответствия, и сайты попросили уточнить данные.

Затраты на оборудование для испытаний

Хотя некоторое оборудование уже принадлежало исследовательским участкам, мы применили закупочную цену 2010 года для всего необходимого оборудования и амортизировали эти затраты в течение рекомендованного срока полезного использования в десять лет, чтобы они были единообразными для разных участков [18].

Стоимость

A за образец для оборудования для конкретных испытаний была рассчитана путем деления общей стоимости на прогнозируемое количество образцов за десять лет с использованием фактического объема испытаний. Затем была рассчитана стоимость оборудования для конкретного теста на образец. Диапазоны, основанные на объеме из других исследовательских центров, также были оценены.

Общее лабораторное оборудование и накладные расходы

В дополнение к материалам и оборудованию для конкретных испытаний, на каждом участке имелось общее лабораторное оборудование, которое использовалось для исследования.Примерами являются стандартные мензурки, шкафы для хранения и т. Д. Кроме того, были накладные расходы, связанные с площадью здания, коммунальными услугами и текущим обслуживанием. Однако было невозможно точно отделить общее лабораторное оборудование и накладные расходы, использованные для текущего исследования, от тех, которые использовались для клинических услуг, не связанных с исследованием. Кроме того, общие расходы на оборудование и накладные расходы на некоторых участках покрывались через национальные государственные системы здравоохранения и не были доступны. Таким образом, накладные расходы были оценены в 69% затрат на персонал, необходимых для проведения вмешательства.В смете накладных расходов учитываются затраты на оборудование, косвенный вспомогательный персонал и другие типичные косвенные расходы, связанные с работой медицинской клиники [19]. Эта цифра основана на данных, показывающих, что косвенные затраты еще на 69% превышают затраты на медицинский персонал [20]. Этот метод использовался в других анализах экономической эффективности [21, 22].

Анализ затрат

Все анализы проводились с точки зрения организации здравоохранения. Расходы на пациентов не отслеживались.Все расходы в местной валюте были конвертированы в доллары США с использованием данных по обмену международных валют, опубликованных на XE.com в июне 2013 года. [Http://www.xe.com/currencyconverter/] Обменный курс составлял 1 доллар = 58,82 индийских рупий, 12,20 молдавских рупий. Лей и 9,70 южноафриканского рэнда. После пересчета в доллары США расходы на персонал для Индии составили 1,52, 1,82 и 4,55 доллара в час для помощника лаборанта, лаборанта и руководителя лаборатории, соответственно. Для Молдовы расходы на персонал составляли 1 доллар.50, 2,50 доллара или 3,50 доллара в час для уборщиц, лаборанта и начальника лаборатории соответственно. В Южной Африке все мероприятия проводились лаборантом с заработной платой 10,30 долларов в час. Средние затраты на образец материалов и персонала были рассчитаны отдельно, а затем объединены в первоначальном дополнительном анализе экономической эффективности «только для операций». Затем в анализ были добавлены затраты на оборудование для конкретных испытаний. Третий анализ отразил добавление накладных расходов.Коэффициенты дополнительной экономической эффективности (ICER) рассчитывались для каждого анализа.

Анализ чувствительности

Анализ чувствительности использовался для изучения того, как изменяются результаты инкрементного анализа экономической эффективности при изменении входных данных. Входные данные, которые либо различались в разных местах, либо могут значительно различаться при других условиях, включали размер партии, почасовую заработную плату лабораторного персонала и образцы за весь срок, обработанные для специального оборудования для испытаний. Таким образом, информативно изучить влияние этих переменных на результаты исследования [23].Анализ чувствительности проводился путем ввода высокого и низкого значения из диапазона значений, описанного ниже, в электронные таблицы Excel, используемые для расчетов. Затем каждый компонент затрат (материалы, персонал, оборудование для испытаний и накладные расходы) был пересчитан и объединен в общую стоимость / образец. Каждый односторонний анализ проверял индивидуальную чувствительность результатов, когда стоимость партии, почасовой оплаты труда и стоимости оборудования варьировалась отдельно. Затем были сложены высокие и низкие значения двух из трех переменных.Двусторонний анализ чувствительности проводился для парных переменных размера партии / средней почасовой оплаты труда и размера партии / средней стоимости оборудования. Первая двухсторонняя пара представляет интерес, потому что в двух исследовательских центрах была как низкая средняя почасовая оплата, так и более высокие размеры партий. Вторая двусторонняя пара представляет интерес, потому что сайты с большим объемом, вероятно, увеличат размер партии, а также снизят стоимость оборудования на выборку, в то время как обратное верно для сайтов с небольшими объемами тестирования. Наконец, был проведен трехкомпонентный анализ чувствительности, в котором варьировался диапазон значений для размера лабораторной партии, средней почасовой оплаты труда и средней стоимости оборудования.Диаграмма чувствительности смерча была построена с использованием дополнительного программного обеспечения Microsoft Excel.

Размеры партий варьировались в разных центрах в зависимости от количества пациентов в каждом учреждении. Партии PSQ были ограничены максимум 12 на партию. Партии теста MGIT были ограничены восемью образцами на лунку. Каждый образец был протестирован со всеми четырьмя тестами, поэтому партии оставались в диапазоне от 5 до 12 на партию, так что один тест не отставал. Мы варьировали размеры партий от минимального до максимального, о котором сообщалось в нашем исследовании.Мы также варьировали расходы на персонал в соответствии с диапазонами, указанными в нашем исследовании.

Как описано выше, почасовая оплата варьировалась от 1,50 до 10,30 долларов в час. Однако затраты на персонал также зависели от времени, затрачиваемого на выполнение каждой задачи, и на предприятиях с более низкой заработной платой, как правило, использовалось несколько уровней укомплектования персоналом.

Поскольку фактический объем тестов, выполненных с нашим исследовательским оборудованием, мог значительно занизить общий потенциальный объем на одну машину, мы изменили объем от самого низкого, наблюдаемого в наших исследовательских центрах, до максимум 2000 тестов DST в год.Мы подсчитали, что PSQ может использовать свои 96 лунок для тестирования 12 образцов x семи препаратов и одного контроля примерно каждые два дня, обеспечивая ТЛЧ примерно на 2000 образцах ежегодно. Хотя с помощью других диагностических инструментов можно было протестировать более 2000 образцов, мы использовали максимум 2000 тестов, чтобы стандартизировать сравнение между тестами.

Тестирование молекулярной чувствительности и лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis на устойчивость к этамбутолу в США

Этамбутол (EMB) используется как часть схем лечения туберкулеза (ТБ).Чувствительность изолятов комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTBC) к EMB можно определить с помощью секвенирования ДНК для выявления мутаций в гене embB , связанных с устойчивостью. Лаборатории общественного здравоохранения США (PHL) в основном используют методы тестирования лекарственной чувствительности (ТЛЧ) на основе роста для определения устойчивости к ЭМВ. Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) предоставляют услуги по молекулярному обнаружению лекарственной устойчивости (MDDR) путем секвенирования ДНК и одновременного ТЛЧ на основе роста с использованием пропорции агара.Результаты тестов PHL и CDC сравнивались для 211 образцов MTBC, представленных в CDC с сентября 2009 г. по февраль 2011 г. Соответствие между результатами ТЛЧ на основе роста от PHL и CDC составило 88,2%. Основанное на росте сравнение 39 образцов, в которых была обнаружена мутация embB , связанная с устойчивостью к EMB, выявило более высокий процент устойчивости к EMB по CDC (84,6%), чем по PHL (59,0%), что было значимым (значение = 0,002). . Расхождения между результатами всех тестов, основанных на росте, от PHL и CDC также были значительными (значение = 0.003). Большинство несоответствий было связано с ложной восприимчивостью с использованием системы, основанной на росте BACTEC MGIT 960 (MGIT). Наш анализ поддерживает объединение результатов на основе роста и молекулярных результатов для информированной интерпретации потенциальной устойчивости к ЭМВ.

1. Введение

В 2014 г. в США было зарегистрировано 9 412 новых случаев туберкулеза (ТБ) [1]. Из этих случаев 96 (1,3%) были классифицированы как множественная лекарственная устойчивость (MDR), определяемая как устойчивость как минимум к рифампину (RMP) и изониазиду (INH).Надежные тесты на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) изолятов комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTBC) необходимы для выбора эффективных схем лечения, прерывания передачи и предотвращения дальнейшего развития устойчивых форм ТБ.

Этамбутол (EMB) в сочетании с INH, RMP и пиразинамидом (PZA) используется как часть схемы лечения туберкулезом первого ряда для пациентов с лекарственно-чувствительным ТБ. EMB часто включается в комбинации с препаратами второго ряда в схему лечения МЛУ-ТБ, когда изолят чувствителен [2–4].EMB представляет собой бактериостатический антимикробный препарат, который препятствует клеточному метаболизму путем ингибирования арабинозилтрансферазы, необходимой для биосинтеза арабиногалактана в клеточной стенке [4, 5]. Мутации в опероне embCAB , который кодирует арабинозилтрансферазу микобактерий, в значительной степени связаны с основанной на росте устойчивостью к EMB [6]. Эти мутации наиболее часто встречаются либо в кодоне embB 306, либо в кодоне embB 406 [7–9].

Несинонимичные мутации были обнаружены в других кодонах за пределами этих мест между кодонами 296 и 497 в EMB-устойчивых изолятах [10].Однако мутации, описанные в этих кодонах, такие как Glu378Ala, могут быть маркерами клонирования, не связанными с устойчивостью [11–14]. Следовательно, нельзя полагаться только на секвенирование ДНК для выявления устойчивости к EMB из-за наличия мутаций, не обеспечивающих устойчивость на основе роста, и потому что могут существовать другие механизмы устойчивости к EMB [13, 14]. Противоречивые результаты среди методов тестирования ТЛЧ на основе роста на устойчивость к EMB были хорошо задокументированы и связаны с трудностями при установлении эквивалентных критических концентраций (CC) [7, 15–19].Кроме того, эксперименты по обмену аллелей продемонстрировали, что некоторые мутации embB 306, такие как Met306Ile, могут приводить только к умеренно повышенной минимальной ингибирующей концентрации (МИК) по сравнению с CC, а изоляты MTBC с этими мутациями могут ошибочно считаться чувствительными [8 , 20]. Как чувствительные к EMB, так и устойчивые к EMB изоляты с мутациями Met306Ile были описаны в одном исследовании, в котором для ТЛЧ на основе роста использовалась пропорция агара [13].

Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) обеспечивают молекулярное обнаружение лекарственной устойчивости (MDDR) посредством секвенирования ДНК локусов, связанных с лекарственной устойчивостью против ТБ, включая устойчивость к EMB, и одновременное ТЛЧ на основе роста.Молекулярное тестирование может проводиться либо с изолятами MTBC, либо с осадками клинических образцов, положительных на MTBC с помощью тестов амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) [13]. Эта услуга доступна по запросу лабораторий общественного здравоохранения (PHL) для образцов, соответствующих определенным критериям подачи [21]. Компания PHL, отправляющая образцы MTBC для тестирования, получает промежуточный отчет с молекулярными результатами и окончательный отчет по завершении ТЛЧ на основе роста. Окончательный отчет содержит пояснительные комментарии, основанные как на молекулярных результатах, так и на результатах роста.Сервис CDC MDDR был описан ранее [22, 23].

Ранее мы исследовали соответствие между молекулярным и основанным на росте ТЛЧ для выявления устойчивости к RIF и INH образцов MTBC, представленных в службу MDDR CDC [23]. В этом исследовании мы сравнили результаты по чувствительности к EMB, полученные с помощью службы MDDR, молекулярные и основанные на росте, с результатами, основанными на росте, предоставленными PHL. Кроме того, мы проанализировали результаты тестов и методы на предмет возможных причин несоответствия.

2. Материалы и методы
2.1. Образцы MTBC и сбор результатов ТЛЧ на основе роста из PHL

Результаты теста EMB, проанализированные для этого исследования, представляли собой изоляты MTBC и NAAT-положительные осадки от больных туберкулезом, представленные PHL в службу MDDR CDC с сентября 2009 по февраль 2011 года. основанные на результатах ТЛЧ и методы тестирования, использованные для этих образцов в PHL, были доступны из ранее описанного исследования, в котором использовался безопасный инструмент опроса для сбора данных онлайн из PHL [23, 24]. CDC определила, что предыдущее исследование не было исследованием на людях; таким образом, он не требовал рассмотрения Советом по институциональному надзору.Результаты ТЛЧ на основе роста для EMB были успешно собраны для 211 образцов MTBC, представленных PHL в течение периода исследования. Сбор всех данных был одобрен в соответствии с общим пакетом разрешений Управления управления и бюджета (OMB) (Сбор информации для повышения эффективности системы, потенциала и реализации программы государственных, племенных, местных и территориальных государственных органов; номер OMB 0920-0879) по мере необходимости. в соответствии с Законом о сокращении бумажного документооборота.

2.2. ТЛЧ на основе роста и секвенирование ДНК

ТЛЧ на основе роста для EMB проводили в CDC с использованием метода непрямого определения пропорции агара с использованием критической концентрации (CC) 5 мкг г / мл в агаре Миддлбрук 7h20 с добавками [25].PHL провела ТЛЧ на основе роста 211 образцов MTBC, представленных в MDDR CDC, с использованием системы BACTEC MGIT 960 (MGIT) (Becton Dickinson and Company) (136 образцов), BACTEC 460 (Becton Dickinson and Company) (45 образцов), BACTEC 460 и пропорция агара (18 образцов), пропорция агара (2 образца), VersaTrek (Trek Diagnostic Systems) (1 образец) или изоляты, которые были переданы в другую лабораторию (9 образцов), где метод ТЛЧ был неизвестен. Секвенирование ДНК для обнаружения мутаций в локусе embB , связанных с лекарственной устойчивостью EMB, было выполнено, как описано ранее [13].

2.3. Анализ данных

Данные ТЛЧ на основе роста из PHL были проанализированы с помощью PASW Statistics (версия 18; программное обеспечение IBM SPSS). Соответствие между тестированием в CDC (как секвенирование ДНК, так и ТЛЧ на основе роста) и тестированием на основе роста, выполняемым PHL, определяли путем сопоставления результатов и расчета процента совпадения. Пропорции выборки сравнивались с использованием критерия Макнемара без поправки на непрерывность с уровнем значимости = 0,05.

3. Результаты и обсуждение
3.1. Сравнение ТЛЧ на основе роста, выполненного с помощью PHL, с секвенированием ДНК и ТЛЧ на основе роста, выполненным CDC

Перекрестное табулирование результатов для определения устойчивости к EMB с помощью ТЛЧ на основе роста с помощью PHL и с помощью секвенирования ДНК и на основе роста ТЛЧ, проведенное CDC, показано в таблице 1. Из 211 образцов MTBC, представленных PHL с соответствующим результатом ТЛЧ на основе роста для EMB, результат ТЛЧ на основе роста не был доступен для сравнения из 30 образцов, протестированных CDC. Отсутствие результатов ТЛЧ на основе роста было связано либо с загрязнением (14 образцов), либо с невозможностью роста (16 образцов).Секвенирование ДНК не проводилось в CDC для 12 образцов, представленных в 2009 году, прежде чем было добавлено молекулярное тестирование на устойчивость к EMB. CDC обнаружил 14 образцов MTBC, которые содержали нейтральный полиморфизм либо Glu378Ala, либо Leu355Leu, чувствительность к EMB подтверждена пропорцией агара CDC. Результаты EMB на основе роста PHL, а также результаты секвенирования ДНК и роста от CDC были доступны для сравнения для 170 из 211 образцов MTBC, перечисленных в таблице 1. Было достигнуто согласие между результатами ТЛЧ на основе роста от PHL и CDC для 150 образцов. в общем согласии 88.2%.

32 , Asp328Gly 9 0631 0 1 9031 9031 9031 9031 Ser346326321 906 32 9062 7 9031 9031 9031 9031 9031 906 0632 9031 9031 9031 9031 901 69031 6 9031 906 31 906 906 906 906 906 906 906 906 906 31 906 906 31 906 906 31 6 9031 9031 6 9031 9031 9031 9031 6 9063 1 0 6326 031 031 1 6 6 1 Всего

Результат ТЛЧ на основе роста PHL для EMB Молекулярный результат CDC для embB (изменение аминокислоты) Результат соотношения агара CDC (количество образцов MTBC)
Устойчивый Восприимчивый Нет роста Загрязненный Общее количество образцов

Устойчивый Met306Ile 4 0 0 1 0 1
Met306Ile, Gly406Ala 1 0 0 3 1 13
Phe330Leu 1 0 0 1
Tyr334His 2 0 0 0 2
9031 9031 Ser346326321 1
Asp354Ala 2 0 1 0 3
Glu378Ala 0 1 0 0 0 2
Gly406Asp 1 0 0 0 1
8
Не выполнено 2 0 0 0 2

Восприимчивый Gly294Gly 0 1 0 0 1
Asn296Tyr 1 0 1 1 0 4
Met306Val 4 0 0 0 4
1
Leu355Leu 0 1 0 0 1
Leu355Leu, Glu378Ala 06 0 9 4 2 15
Gly406Ala 0 2 0 2
Gly406Cys 2 1 0 0 3
Gly406Ser
Без мутаций 6 105 2 9 122
Не выполнено 0 9 0 1
45 136 16 14 211

PHL: лаборатория общественного здравоохранения; ТЛЧ: тестирование лекарственной чувствительности; CDC: Центры по контролю и профилактике заболеваний; EMB: этамбутол; MTBC: Комплекс Mycobacterium tuberculosis .

Перекрестная таблица того, была ли обнаружена мутация embB , связанная с устойчивостью к EMB, с использованием секвенирования ДНК образцов MTBC с помощью CDC с числом устойчивых к DST на основе роста как в PHL, так и в CDC, показано в таблице 2 Секвенирование ДНК показало, что 39 образцов (22,9%) из 170 образцов MTBC с результатами на основе роста, доступными как от PHL, так и от CDC, содержали мутацию embB , связанную с устойчивостью. Когда была обнаружена мутация embB , связанная с устойчивостью, более высокий процент (84.6%) этих образцов оказались устойчивыми с использованием ТЛЧ на основе роста в CDC по пропорции агара по сравнению с ТЛЧ на основе роста, выполненным с помощью PHL (59,0%), и эта разница была значимой (значение = 0,002). Не было значительной разницы в результатах ТЛЧ на основе роста между CDC и PHL для образцов MTBC, в которых не было обнаружено мутации (значение = 0,317). Однако для всех 170 исследованных образцов MTBC была значительная разница (значение = 0,003) между основанным на росте определением устойчивости к EMB, выполненным PHL, и определением, проведенным CDC.

значение PHL 276


Обнаружение мутации embB с помощью CDC MDDR Количество образцов Количество EMB-устойчивых образцов MTBC (%) значение PHL
Пропорция агара CDC

Да 39 23 (59,0) 33 (84,6) 0,002
Нет 131 13134) 10 (7,63) 0,317

Итого 170 30 (17,6) 43 (25,3) 0,003 Включая образцы с полиморфизмами Glu378Ala и Leu355Leu, не связанными с устойчивостью к EMB.
CDC: Центры по контролю и профилактике заболеваний; PHL: лаборатория общественного здравоохранения; ТЛЧ: тестирование лекарственной чувствительности; EMB: этамбутол; MTBC: Mycobacterium tuberculosis комплекс; MDDR: молекулярное определение лекарственной устойчивости.
3.2. Несоответствие между ТЛЧ на основе роста, выполненным PHL и CDC

Несогласованные результаты между PHL и CDC, включая используемые методы ТЛЧ, перечислены в таблице 3. Было 20 несогласованных результатов тестов между ТЛЧ на основе роста, выполненным PHL, и пропорцией агара, выполненной CDC из которых 16 (80%) образцов оказались чувствительными к EMB посредством PHL и устойчивыми к EMB посредством CDC. Среди этих 16 образцов наиболее часто используемым в PHL методом ТЛЧ на основе роста был MGIT (11 образцов).Для 10 из этих 16 образцов тестирование CDC выявило мутаций embB , связанных с резистентностью к EMB, либо по кодону 306 (6 образцов), либо по кодону 406 (3 образца), либо по кодону 296 (1 образец). Для шести других противоречивых результатов в этой категории секвенирование ДНК с помощью CDC не обнаружило мутации embB . Однако сообщалось, что изоляты MTBC могут быть устойчивыми к EMB при использовании пропорции агара без молекулярного обнаружения мутации embB [13, 26]. Для трех образцов MTBC с противоречивыми результатами PHL сообщил об устойчивости к EMB с помощью MGIT, в то время как молекулярное тестирование CDC не обнаружило мутации embB , и эти образцы были чувствительны с использованием пропорции агара.PHL также сообщил об устойчивости к EMB с использованием MGIT для одного образца, где молекулярное тестирование в CDC обнаружило мутацию, не связанную с устойчивостью embB в кодоне 378 (Glu378Ala), и обнаружило, что она чувствительна к EMB в зависимости от пропорции агара.

9031 632632 6 632 9031 906 931 906 MG632 931 906

Количество образцов Результат ТЛЧ на основе роста PHL Метод ТЛЧ на основе роста PHL embB пропорция мутации, обнаруженная с помощью CDC MDDR результат
1 Восприимчивый BACTEC 460 и пропорция агара Asn296Tyr Устойчивый
1 Восприимчивый BACTEC 460 и пропорции агара Met306Ile Устойчивый
3 Восприимчивый MGIT 960 Met306Val Устойчивый
Устойчивый
1 Устойчивый
1 Устойчивый
1 Резистентный
1
1 Устойчивый MGIT 960 Glu378Ala Восприимчивый
2 Восприимчивый MGIT 960 Gly406 9031 9027 9027 Gly406Ser Устойчивый
3 Устойчивый MGIT 960 Отсутствует Восприимчивый
5 Восприимчивый Не выполняется собственными силами Нет Устойчивый

PHL: лаборатория общественного здравоохранения; ТЛЧ: тестирование лекарственной чувствительности; CDC: Центры по контролю и профилактике заболеваний; MDDR: молекулярное определение лекарственной устойчивости.

Комбинированные результаты молекулярных тестов и тестов роста от CDC предполагают, что наибольшее несоответствие с ТЛЧ на основе роста PHL было связано с ложной восприимчивостью к EMB. Ложная восприимчивость к EMB может возникать по разным причинам. Некоторые устойчивые к EMB штаммы лучше растут на твердых средах по сравнению с жидкими средами (такими как среды, используемые с системой MGIT) [16, 18]. Следовательно, даже несмотря на то, что рекомендованные CC для определения первичной устойчивости к EMB для MGIT и пропорции агара составляют 5 мк г / мл, эти тестовые концентрации могут не быть эквивалентными при сравнении результатов с использованием этих методов тестирования [27].Специфические мутации могут влиять на MIC изолята, так что вариабельность вокруг CC обусловлена ​​близостью MIC к CC, что влияет на ложную восприимчивость в MGIT. Гетерорезистентность может присутствовать при позднем росте устойчивых мутантов на твердой среде в присутствии EMB с невозможностью обнаружения этих мутантов в системе MGIT на жидкой основе из-за отсутствия роста [17].

4. Выводы

Большинство лабораторий полагаются на один метод ТЛЧ, основанный на росте, такой как хорошо зарекомендовавшая себя система MGIT.Хотя система MGIT оказалась надежной для ТЛЧ на основе роста изолятов MTBC для большинства противотуберкулезных препаратов, в этом исследовании и в предыдущих отчетах были обнаружены противоречивые результаты, когда этот метод использовался исключительно для определения устойчивости к EMB [16, 18, 19, 28]. Предоставляя как молекулярное обнаружение, так и ТЛЧ на основе роста в зависимости от пропорции агара, MDDR CDC обнаружил значительно большее количество образцов MTBC, устойчивых к EMB, чем PHL, в которых использовались только методы, основанные на росте. Наши результаты подтверждают важность сочетания молекулярного тестирования с надежным методом ТЛЧ на основе роста для точного выявления ТБ, устойчивого к EMB.

Раскрытие информации

Выводы и заключения в этом отчете принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Центров по контролю и профилактике заболеваний или Агентства по токсичным веществам и регистрации заболеваний.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов относительно публикации этой статьи.

Благодарности

Авторы выражают признательность лабораториям общественного здравоохранения за предоставленные данные.

Цветовой тест на МЛУ / ШЛУ-ТБ для тестирования лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis, Северо-Западная Эфиопия

Основные моменты

Цветовой тест на МЛУ / ШЛУ-ТБ был быстрым и простым и использовался для тестирования лекарственной чувствительности.

Цветовой тест имел высокую чувствительность и специфичность для определения устойчивости к рифампицину, туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и устойчивости к ципрофлоксацину.

Цветовой тест имел низкую чувствительность и высокую специфичность для определения устойчивости к изониазиду.

Реферат

Предпосылки

Для проведения Mycobacterium tuberculosis тестирования лекарственной чувствительности (ТЛЧ) в условиях ограниченных ресурсов необходимы соответствующие технологические тесты. Это исследование было проведено для оценки цветового теста МЛУ / ШЛУ-ТБ (тест с цветным пластинчатым агаром; TB-CX) для M. tuberculosis DST путем непосредственного тестирования мокроты в больнице Университета Гондэра.

Методы

Образцы мокроты были разделены на две аликвоты.Одну аликвоту смешивали с дезинфицирующим средством и наносили непосредственно на чашку Петри квадранта TB-CX, содержащую культуральную среду с изониазидом, рифампицином или ципрофлоксацином или без них. Одновременно другую аликвоту обеззараживали гидроксидом натрия, центрифугировали и культивировали на среде Левенштейна-Йенсена; сохраненные изолятов M. tuberculosis затем субкультивировали в пробирке BACTEC Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) 960 для эталонного ТЛЧ.

Результаты

Тест TB-CX дал результаты ТЛЧ для 94% (123/131) положительных образцов.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

2008 - 2021 | Охотники за сердцами